離心淘洗技術在研究白色念珠菌中的應用

李萬杰，張俊杰

（北京師范大學 生命科學學院，細胞增殖及調控生物學教育部重點實驗室，北京 100875）

離心淘洗技術（centrifugal elutriation，CE）是一種根據(jù)樣品密度差異加以區(qū)分樣品的技術，廣泛應用于醫(yī)學和生物學中細胞分離、細胞亞群制備等方面。該技術能夠針對懸浮狀態(tài)或者可以制成單細胞狀態(tài)的活體組織、培養(yǎng)細胞進行精細分離以獲得所需的細胞亞群［1－2］。由于不同時相的細胞具有不同的密度，離心淘洗技術也廣泛應用于獲得同步化細胞等方面［3］。

白色念珠菌（Candidaalbicans）是一種常見的機會性致病真菌，通常存在于大多數(shù)健康人群的胃腸道菌群、口腔黏膜以及生殖器。在免疫系統(tǒng)失調病人中，盡管有抗真菌治療，血液感染也有可能是致命的［4－6］，故深入研究白色念珠菌致病機制能夠為研發(fā)新的抗真菌藥物奠定理論基礎并提供研究方向。白色念珠菌能夠根據(jù)外界信號在酵母形態(tài)、真菌絲和假菌絲之間自由轉換。有證據(jù)表明，白色念珠菌的致病性與其形態(tài)密切相關［7－8］。同時最近的研究也表明，白色念珠菌細胞周期調控也與其致病性相關聯(lián)［9－10］，獲得同步化的白色念珠菌是研究其細胞周期調控的基礎；但是在自然條件或者外界刺激條件下，白色念珠菌很容易形成假菌絲，這對同步化技術提出了巨大的挑戰(zhàn)。我們選用野生型菌株（SC5314）、cla4基因缺失突變體和grr1基因缺失突變體作為實驗樣品，由于這兩種突變體均表現(xiàn)為高度伸長并有分枝的假菌絲形態(tài)［11－12］，故可代表大多數(shù)情況下假菌絲狀態(tài)的白色念珠菌。本實驗利用離心淘洗技術分離出大小均一的同步化細胞，并對其進行后續(xù)培養(yǎng)和觀察，驗證離心淘洗技術同步化不同形態(tài)白色念珠菌的可行性。

1 實驗材料與儀器

材料：用GalMM培養(yǎng)基（0.67%YNB＋2%半乳糖）培養(yǎng)過夜的SC5314、cla4Δ和grr1Δ菌株、磷酸鹽緩沖液（PBS）、GalMM培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基（2%蛋白胨＋1%酵母提取物＋2%葡萄糖）。

儀器：貝克曼離心機Avanti J－E，離心淘洗轉頭JE－6B，蠕動泵，超聲細胞破碎儀，光學顯微鏡，蔡司激光共聚焦顯微鏡LSM700等。

2 實驗方法

2.1 樣本制備

（1）實驗前活化白色念珠菌。從新鮮YPD平板上挑取單克隆，接至5mL的YPD培養(yǎng)基中，在30℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜。

（2）擴大培養(yǎng)。將活化后的白色念珠菌全部轉至200mL的GalMM培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)6h。

（3）制備離心淘洗樣本。由于白色念珠菌容易發(fā)生粘連現(xiàn)象，即胞質分裂后細胞并不分開而繼續(xù)進入下一個細胞周期，這樣一方面容易造成離心淘洗管路堵塞，另一方面也會降低同步化的G1期細胞的產(chǎn)量。為了消除這方面的影響，將培養(yǎng)物分裝到無菌的50mL離心管中，在冰浴的條件下，使用3mm超聲探頭超聲20s（每超聲2s暫停1s，共20s）。鏡檢超聲后產(chǎn)物，絕大部分白色念珠菌在視野中呈現(xiàn)單細胞狀態(tài)（超過80%）。如果超聲效果不理想，需要重復超聲一次。隨后合并預處理好的樣品至500mL三角瓶中。

2.2 離心機預處理

（1）離心淘洗管路消毒。組裝、放置好JE－6B轉頭，并將離心機溫度設定為12℃；將進水管插入盛有1L無菌水的燒杯中，啟動蠕動泵，調節(jié)至6mL／min，清洗管道并排出全部氣泡；待氣泡完全去除后將進水管插入1L的70%乙醇中，對管路消毒。

（2）徹底清洗管路。待70%乙醇幾乎完全進入離心淘洗管路后，將進水管迅速插入2L無菌水中，徹底清洗管路除去殘留的乙醇，隨后關閉蠕動泵。整個過程避免產(chǎn)生氣泡。

2.3 上機分離

（1）進樣。啟動離心機，設定其轉速為4 000 r／min，同時開啟蠕動泵，并將其流速調至3.5mL／min；待轉速穩(wěn)定后，將進水管口迅速從無菌水中移出并插入菌液中，從離心機蓋上的觀察口可看到菌液進入離心淘洗腔內(nèi)（見圖1（a））；待細胞邊界接近淘洗腔中最寬的位置時，即表明腔內(nèi)細胞已經(jīng)飽和（見圖1（b）），將進水管口迅速插入準備好的GalMM培養(yǎng)基中。

（2）分離不同時相細胞。將蠕動泵流速調至4.0 mL／min，并注意收集出水口流出的液體（培養(yǎng)基）是否含有細胞。收集不同流速的流出物，流速遞增，步幅為0.5mL／min。收集到的流出物始終處于冰浴狀態(tài)，并對流出物進行鏡檢，確定細胞形態(tài)及大小。

（3）收集細胞。將不同流速組分離心收集的細胞沉淀，離心條件為4 000（相對離心率）、10min，并用冰冷的GalMM培養(yǎng)基重懸。

圖1 離心淘洗原理示意圖（引自Beckman Culter產(chǎn)品目錄）

2.4 清洗機器

（1）排出剩余細胞。將進水口插入盛有1L蒸餾水的燒杯中，并將蠕動泵的流速調節(jié)至6mL／min，將管路中殘留的白色念珠菌完全洗出。

（2）管路消毒。將進水口插入盛有200mL、70%乙醇的燒杯中，保持流速在6mL／min，對管路進行消毒；隨后再通入1L無菌水清洗管路，去除殘留的乙醇。

3 實驗結果與討論

實驗中收集得到的同步化細胞還將繼續(xù)其他實驗，操作的過程中要注意無菌操作。

3.1 cla4Δ突變體同步化結果分析

盡管cla4Δ缺失突變體（見圖2（a））細胞表現(xiàn)出芽體伸長以及高度分支的表型，但是通過超聲波預處理后在培養(yǎng)基中仍可以發(fā)現(xiàn)單獨的細胞。對離心淘洗不同流出組分進行鏡檢，其中流速為3.5mL／min的流出物為細胞碎片和雜質，從4.0mL／min（簡稱4.0組分）開始出現(xiàn)細胞。對同步化效果好（細胞大小均一）、處于不同時相的白色念珠菌用冰冷的GalMM培養(yǎng)基重懸并保存在冰上備用。選取均一的G1期白色念珠菌（4.0組分），用含有YPD液體培養(yǎng)基在30℃條件下振蕩培養(yǎng)，并在不同時間點取樣鏡檢（見圖2（c））。4.0組分可以實現(xiàn)很好的同步化，所有細胞在一個細胞周期內(nèi)均能保持生長狀態(tài)一致。

3.2 grr1Δ突變體同步化結果分析

grr1Δ基因缺失突變體（見圖2（b））細胞表現(xiàn)為高度伸長并帶有分枝的假菌絲狀態(tài)，在其假菌絲的頂端仍然會產(chǎn)生少量單個細胞，通過超聲處理會提高同步細胞的產(chǎn)量。經(jīng)過離心淘洗同步化grr1Δ突變體以及野生型細胞，獲得均一的G1期細胞。通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，grr1Δ突變體的 G1期細胞較大，4.5mL／min（簡稱4.5組分）才開始出現(xiàn)單獨完整的細胞，而野生型與cla4Δ突變體基本一致，即在4.0mL／min時出現(xiàn)細胞。對同步的grr1Δ突變體和野生型細胞（均為4.5組分）轉移至含有20%小牛血清的YPD培養(yǎng)基中，并在37℃條件下培養(yǎng)，誘導其生成菌絲，在不同時間點對其鏡檢（見圖3）。由圖3可知，通過離心淘洗獲得的均一化G1期細胞在誘導條件下，能夠保持相同的菌絲生長速度，即實現(xiàn)了對假菌絲狀態(tài)的白色念珠菌的同步化。

圖2 假菌絲形態(tài)的白色念珠菌同步化結果

圖3 grr1Δ突變體

3.3 離心淘洗操作注意事項

（1）離心淘洗的樣本細胞要在GalMM培養(yǎng)基中培養(yǎng)足夠長的時間，由于GalMM培養(yǎng)基中半乳糖作為唯一碳源，而白色念珠菌對半乳糖的利用率明顯低于葡萄糖，故其處于G1期的細胞比例更大，即獲得更高的產(chǎn)率。

（2）整個實驗過程無菌操作非常重要，所有用具都應提前滅菌。另一方面用于消毒的70%乙醇也可以用2%的次氯酸鈉代替，但消毒液一定要用蒸餾水清洗干凈，否則會造成機器金屬部件氧化腐蝕。

（3）嚴格避免管路中出現(xiàn)氣泡，否則容易造成管路堵塞。在離心過程中切不可斷流或者關閉蠕動泵，同樣會造成淘洗腔的入口處細胞堆積堵塞。

4 結論

本文選用白色念珠菌野生型SC5314菌株以及具有高度伸長和分枝狀態(tài)的cla4Δ和grr1Δ突變菌株作為實驗材料，利用離心淘洗技術分離得到同步化細胞。對于野生型菌株，我們可以得到G1期甚至是S期和M期的細胞，主要是由于各個時期的細胞具有不同的密度。而對于具有假菌絲形態(tài)的白色念珠菌，我們僅能獲得單個的G1期細胞，而其他時相的組分往往會混雜其他形態(tài)，但是我們完全可以通過對同步化的G1期細胞進行后續(xù)培養(yǎng)以獲得不同時相的細胞。利用離心淘洗技術可以實現(xiàn)對不同形態(tài)的白色念珠菌進行同步均一化，為研究其細胞周期依賴的菌絲形態(tài)發(fā)生提供了很好的材料和方法，同時也避免了細胞周期阻斷藥物對其細胞形態(tài)的影響。

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