八棱海棠類Caspase基因cDNA的克隆及序列分析

曹 慧，劉春香，姜倩倩，張淑芝，許瑞瑞

（濰坊學(xué)院 山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261061）

天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶（aspartatespecific cysteinyl proteinase，Caspase）家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的一類重要蛋白酶［1］，廣泛參與植物的各種生理過程。在植物正常發(fā)育階段半胱氨酸蛋白酶mRNA低水平表達(dá)，在低溫、鹽和干旱等環(huán)境脅迫條件下，半胱氨酸蛋白酶 mRNA表達(dá)量升高［2－3］。在植物發(fā)育階段的細(xì)胞程序化死亡過程中以及衰老期的植物器官中［4］，半胱氨酸蛋白酶mRNA含量也會(huì)增加，顯示植物的細(xì)胞程序化死亡與半胱氨酸蛋白酶有關(guān)［5］。

植物細(xì)胞程序化死亡的研究對(duì)于揭示高等植物生長(zhǎng)發(fā)育及與環(huán)境相互作用機(jī)制和指導(dǎo)育種實(shí)踐等方面有著重要而廣泛的意義，Caspase基因作為執(zhí)行細(xì)胞凋亡的一類重要蛋白酶已成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。與醫(yī)學(xué)和動(dòng)物Caspase基因的研究相比，植物Caspase基因研究仍處于起步階段。目前只從少數(shù)植物中克隆了編碼該酶的基因，例如山杏［6］、葡萄［7］、獼猴桃［8］等。本試驗(yàn)以蘋果屬植物八棱海棠為試驗(yàn)材料，采用RT－PCR、巢式PCR、3’RACE、5’RACE技術(shù)克隆到了八棱海棠Caspase基因cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析，為進(jìn)一步研究其活性和表達(dá)的變化，以及進(jìn)一步探究八棱海棠在環(huán)境脅迫條件下的適應(yīng)能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

供試材料為抗旱性較強(qiáng)的八棱海棠（MalusrobustaRehd.）。精選種子，4℃冰箱層積處理。發(fā)芽后種子植入花盆，待長(zhǎng)出4到6片真葉時(shí)進(jìn)行營養(yǎng)液水培，水培1周后用含有20%PEG6000的營養(yǎng)液（－0.63MPa）進(jìn)行中度干旱脅迫 24h，提取葉片RNA。AMV反轉(zhuǎn)錄酶、3’－Full RACE Core Set、pMD20－T Vector、Taq酶均為 TaKaRa公司產(chǎn)品，JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存。

參照美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）上已發(fā)表的Caspase基因分析其保守序列，設(shè)計(jì)兩條特異性引物F0：5’－TGGAAAGAAGAAGGCATAGTGA－3’和 R0：5’－GCAAGCACCGTCTACTCCAA－3’，用 于 RT－PCR擴(kuò)增。根據(jù)RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)3’RACE上游兩條嵌套引物 F0： 5’－TGGAAAGAAGAAGGCATAGTGA－3’和 F1：5’－TTGGAAAGCAAATCTCCCTCT－3；設(shè) 計(jì) R1：5’－GCAGCCGTTGTTGTTGAAAT－3’和 R2：5’－GCTCCAGTGGTGCTGAATGT－3’兩條嵌套引物。3’RACE 參照TaKaRa公司的3’RACE試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件為：94℃、3min，1個(gè)循環(huán)；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10min；4 ℃保存。5’RACE參照TaKaRa公司的5’RACE試劑盒說明書進(jìn)行，PCR擴(kuò)增條件為：94℃、3min，1個(gè)循環(huán)；94℃、30s，60℃、30s，72℃、2min，30個(gè)循環(huán)；72℃、10min；4℃保存。PCR法鑒定的陽性克隆由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心測(cè)序部進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果用DNA man軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)分析，利用SignalP（www.psort.com）對(duì)其氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 八棱海棠類Caspase基因cDNA的RT－PCR擴(kuò)增

以八棱海棠總RNA反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，利用一對(duì)特異引物F0和R0進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出了一條約280bp的條帶（見圖1）。藍(lán)白斑篩選后，對(duì)陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物與目的片段大小相符。

圖1 八棱海棠類Caspase基因特異序列RT－PCR分析

2.2 八棱海棠類Caspase基因cDNA的3’RACE和5’RACE擴(kuò)增

根據(jù)RT－PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)的2條正向嵌套引物F0和F1分別用于3’端第1輪和第2輪PCR擴(kuò)增。3’RACE首輪擴(kuò)增沒有明顯的特異條帶出現(xiàn)，以首輪PCR反應(yīng)液為模板，用內(nèi)側(cè)引物對(duì)首輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，得到1條約846bp的特異條帶（見圖2（a））。分別用引物5’RACE Outer Primer、R1和5’RACE Inner Primer、R2進(jìn)行5’RACE 首輪和巢式PCR擴(kuò)增。5’RACE首輪也沒有擴(kuò)增出明顯的特異條帶，第2輪擴(kuò)增出1條約627bp的特異條帶（見圖2（b））。對(duì)3’RACE 與5’RACE陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒測(cè)序片段大小分別與目的片段大小相同，表明目的片段已克隆成功。

圖2 3’RACE和5’RACE PCR 擴(kuò)增

2.3 八棱海棠類Caspase基因cDNA全長(zhǎng)序列分析

RT－PCR和3’RACE、5’RACE巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的陽性克隆并經(jīng)過雙向測(cè)序，RT－PCR獲得了276 bp的片段，3’RACE巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為846bp，5’RACE巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為627bp。將3段序列拼接，獲得的八棱海棠Caspase基因cDNA全長(zhǎng)1 429 bp（見圖3）。序列測(cè)序結(jié)果顯示5’端的起始密碼子ATG前有一段非編碼區(qū)，而3’末端有一段polyA多聚核苷酸結(jié)構(gòu)，說明了序列的完整性，符合有效翻譯的基因全長(zhǎng)cDNA的特征。

經(jīng)BLAST分析，八棱海棠Caspase基因cDNA與山杏Caspase基因mRNA序列的同源性高達(dá)86%；與葡萄、獼猴桃（XM＿002278588.2）同源性為82%。

2.4 八棱海棠類Caspase基因推測(cè)的氨基酸序列分析

利用DNA man軟件分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列開放閱讀框（ORF）為1 077bp，編碼358個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為38.78ku（見圖4）。

圖3 八棱海棠類Caspase基因cDNA序列

圖4 八棱海棠類Caspase基因推測(cè)的氨基酸序列

利用SignalP（www.Psort.com）對(duì)其氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果見圖5，發(fā)現(xiàn)N端有一個(gè)23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，切割點(diǎn)在第23位Ala和第24位Ala氨基酸之間。信號(hào)肽序列為MARLTLFLSAALALAAISCVAAA。

圖5 八棱海棠類Caspase氨基酸序列信號(hào)肽分析

通過Blast對(duì)比，將與八棱海棠類Caspase基因同源性較高的基因序列一起構(gòu)建進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖6，可知八棱海棠與山杏（U93166.1）在該基因座位上親緣關(guān)系最近，屬于一個(gè)分支。

圖6 八棱海棠類Caspase序列與GenBank中序列同源性比較

3 討論

Caspase家族蛋白酶經(jīng)過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過不同的信號(hào)途徑參與多種類型的細(xì)胞凋亡［9］。近年來，隨著醫(yī)學(xué)和動(dòng)物中Caspase基因研究取得長(zhǎng)足進(jìn)展，植物細(xì)胞的程序性死亡也受到廣泛關(guān)注，Caspase基因作為其中的關(guān)鍵酶，已成為植物逆境脅迫研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)［10－14］。

作為直接導(dǎo)致PCD過程中細(xì)胞原生質(zhì)解體的蛋白酶系統(tǒng)，Caspase控制著PCD的信號(hào)傳導(dǎo)和實(shí)施過程［15］，現(xiàn)已從山杏、葡萄、獼猴桃等植物中克隆了編碼該酶的基因。盡管對(duì)于半胱氨酸蛋白酶如何被生長(zhǎng)發(fā)育或外部刺激信號(hào)激活，以及其如何參與調(diào)控細(xì)胞死亡的具體過程還不清楚，但Caspase家族成員在空間結(jié)構(gòu)上具有相似，并且在氨基酸序列上具有同源性。

本研究通過干旱脅迫誘導(dǎo)蘋果屬植物八棱海棠發(fā)生PCD，提取葉片總RNA進(jìn)行RT－PCR，獲得同源驗(yàn)證序列，再利用巢式PCR技術(shù)從八棱海棠成功分離出類半胱氨酸蛋白酶基因cDNA 1 429bp的全長(zhǎng)序列。序列分析表明，Caspase基因cDNA序列編碼358個(gè)氨基酸，N端含有1個(gè)23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，第23位與第24位之間存在Ala切割位點(diǎn)，預(yù)示這個(gè)位點(diǎn)可能與此蛋白酶折疊、分泌過程有關(guān)［16－17］。與 GeneBank中其他半胱氨酸蛋白酶基因的同源性為78%～86%，分析表明這個(gè)新基因與山杏親緣關(guān)系最近，屬于同一半胱氨酸蛋白酶分支。

天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的一類重要蛋白酶，廣泛參與植物的各種生理過程。本研究首次從八棱海棠中克隆得到類半胱氨酸蛋白酶基因，為探索應(yīng)用半胱氨酸蛋白酶分子培育抗性蘋果屬植物提供了目標(biāo)基因，也為進(jìn)一步發(fā)展基于Caspase基因家族的基因工程提供了新的靶標(biāo)。

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