基因缺失豬繁殖與呼吸綜合征病毒河北株HB－Xt1的分離鑒定及其生長特性

趙駐軍，宋勤葉，李 曼

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)華北區(qū)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，河北 保定071000）

近年來河北省高致病性PRRS病例屢屢發(fā)生，為了弄清本地區(qū)流行的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株的分子特征和生物學(xué)特性，本實(shí)驗(yàn)室從河北省某豬場(chǎng)疑似PRRS死亡仔豬的脾臟和淋巴結(jié)混合物內(nèi)分離到的1株高致病性PRRSV，明確了其體外培養(yǎng)特性，以便為進(jìn)一步研究該毒株的致病性及相應(yīng)的弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 MARC－145細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs Mixture、Taq DNA聚合酶等，均購自天根生化科技（北京）有限公司；鼠抗PRRSV E蛋白多克隆抗體和鼠抗PRRSV陰性血清，由本實(shí)驗(yàn)制備；兔抗鼠IgG酶標(biāo)二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集及處理 無菌采集疑似PRRS病豬的脾和淋巴結(jié)，研磨后，用PBS（0.01mol／L pH 值7.2）制成1∶3組織懸液，反復(fù)凍融3次后，8 000r／min離心10min，取上清液加入1 000IU（μg）／mL的青霉素、鏈霉素，作用過夜，備用。

1.3 病毒的分離培養(yǎng) 取制備好的組織懸液過濾除菌后，接種于生長良好的 MARC－145細(xì)胞單層上，37℃5%CO2條件下吸附1h，加入含2%小牛血清的細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)72h，收獲培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次。取凍融液1mL盲傳5代，收獲病毒（分離病毒命名為 HB－Xt1），－20℃保存待檢。在培養(yǎng)過程中定時(shí)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。

1.4 分離毒株的IPMA檢測(cè) 取收獲的F3代分離毒接于MARC－145細(xì)胞，培養(yǎng)50～60h時(shí)，應(yīng)用免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)檢測(cè)［5］。DAB顯色后，觀察細(xì)胞內(nèi)的陽性信號(hào)（棕褐色沉淀物）。同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照和陰性血清對(duì)照。

1.5 分離毒株ORF5全基因和Nsp2部分基因序列的測(cè)定與分析用引物P1－P2（P1：5′－AGCCTGTCTTTTTGCCAT－3′，P2：5′－CTTTTCTGGAGCCGTGCTATC－3′）、P3－P4（P3：5′－CCTCCGTGGTGCAACAAATCTTG－3′，P4：5′－CGATGATGGCTTGAGCTGAGTAT －3′）分 別 擴(kuò) 增 PRRSV 的 ORF5（682bp）和Nsp2基因片段（1 064bp）。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min；94℃1min，56～59℃1min，72℃1min，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10min。取PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對(duì)克隆的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定，并用生物學(xué)軟件MEGA5.05進(jìn)行分析。

1.6 不同代次病毒的TCID50測(cè)定 將分離病毒于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)72h，收獲病毒，繼續(xù)傳代至第5代（F5）。通過IPMA測(cè)定F1～F5代病毒的TCID50。

1.7 病毒的增殖動(dòng)態(tài)檢測(cè) 將分離的F5代病毒，接種到 MARC－145細(xì)胞上，于37℃5%CO2下培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h時(shí)收獲病毒，通過IPMA分別測(cè)定不同時(shí)間收獲病毒的TCID50，以分析病毒在細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 分離病毒在 MARC－145細(xì)胞中增殖可導(dǎo)致CPE 將經(jīng)處理的脾和淋巴結(jié)勻漿接種到MARC－145細(xì)胞單層培養(yǎng)至60h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)變暗、圓縮、聚集等細(xì)胞病變效應(yīng)，至72h時(shí)可見部分細(xì)胞崩解、脫落現(xiàn)象（見中插彩版圖1）。F3代后CPE穩(wěn)定在60h左右出現(xiàn)。

2.2 分離毒株能夠與抗PRRSV陽性血清特異性結(jié)合 F3代分離病毒接種到MARC－145細(xì)胞培養(yǎng)50～60h時(shí)，應(yīng)用IPMA檢測(cè)，可見細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)特異性棕褐色沉淀物，而對(duì)照細(xì)胞漿內(nèi)無棕褐色沉淀物形成。該結(jié)果表明，分離病毒能夠與抗PRRSV陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)有PRRSV增殖（見中插彩版圖2）。

2.3 分離毒株ORF5序列和非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2部分基因序列的分析 應(yīng)用生物學(xué)軟件MEGA 5.05和DNAMAN序列分析表明，分離毒株的ORF5序列（GenBank收錄號(hào)：EU008759）與2006年后國內(nèi)流行的高致病性PRRSV毒株JXA1、HuB2、HBTsh1等的相似性在99.8%以上；與2006年前國內(nèi)的PRRSV分離株CH－1a的相似性為95.36%，而與國內(nèi)BJ－4株和美國分離株VR－2332的相似性較低，分別為88.39%和89.22%。

對(duì)Nsp2部分基因序列的分析結(jié)果同樣顯示，分離株與2006年后國內(nèi)流行的高致病性PRRSV分離株Nsp2基因相應(yīng)序列的相似性最高（約99.7%），也存在兩處缺失，即缺失3bp和87bp，共計(jì)缺失30aa；與之前國內(nèi)流行的代表毒株CH－1a、BJ－4以及美洲型代表株VR－2332的相似性較低（分別為84.3%、72.4%和72.4%）。

對(duì)分離毒株ORF5序列和Nsp2基因部分序列的遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果均顯示，分離株與美洲型毒株同處于一個(gè)大分支，與2006年后國內(nèi)分離的高致病性PRRSV Nsp2基因缺失毒株的遺傳關(guān)系最近，與早期（2001年）分離株CH－1a和BJ－4的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。與BJ－4株相比，分離株與CH－1a的遺傳關(guān)系較近（圖略）。

2.4 不同代次分離毒株的TCID50測(cè)定 F1～F5代分離毒株在MARC－145細(xì)胞上培養(yǎng)72h時(shí)的毒價(jià)分 別為104.95±0.05、105.45±0.06、105.69±0.04、105.90±0.04和106.31±0.03?？梢?，隨著傳代次數(shù)的增加，TCID50逐漸上升，F(xiàn)4代后，TCID50穩(wěn)定在106.0TCID50／mL左右。

2.5 分離毒株的增殖動(dòng)態(tài) 分離毒株（F5代）在MARC－145細(xì)胞上培養(yǎng)72h時(shí)，病毒滴度達(dá)到最高水平，為106.12±0.025／mL，隨后逐漸下降，至120h時(shí)病毒滴度降低為105.18±0.025／mL（圖3）。

圖3 分離株 HB－Xt1（F5代）在 MARC－145細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)

3 討論

PRRSV具有較嚴(yán)格的宿主細(xì)胞特異性，豬肺泡巨噬細(xì)胞是分離培養(yǎng)本病毒的最佳細(xì)胞，其次PRRSV還可在恒河猴腎細(xì)胞系MA－104及其衍生細(xì)胞系（MARC－145、CL－2621、CRL－1171、HS.2H）中增殖，其中對(duì) MARC－145細(xì)胞具有高度敏感性［6］。由于PAM制備不方便，容易污染其他病原微生物，因此本試驗(yàn)中選擇MARC－145細(xì)胞用于病毒分離。分離毒株HB－Xt1能夠在MARC－145細(xì)胞中增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞變暗、圓縮、聚集、崩解、脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)，此與PRRSV的培養(yǎng)特性一致［6］。通過IPMA證明，分離病毒能夠與鼠抗PRRSV E蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，表明分離病毒HB－Xt1為PRRSV。進(jìn)一步觀察IPMA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)陽性信號(hào)（病毒感染細(xì)胞）呈簇狀分布（見中插彩版圖2A），說明病毒是通過細(xì)胞間傳播方式感染相鄰MARC－145細(xì)胞的，此現(xiàn)象與Cafruny等（2006）［7］的報(bào)道一致。

已知無論歐洲型還是美洲型PRRSV不同分離株的核苷酸序列均存在著廣泛而明顯的變異，并且變異速率較快［8－9］。在PRRSV基因組內(nèi)以病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp）編碼區(qū)ORF1a和結(jié)構(gòu)蛋白E編碼區(qū)（ORF5）的變異較大，ORF1a中的變異主要集中在Nsp1β和Nsp2編碼區(qū)［8］。2006年以來，國內(nèi)流行的高致病性PRRS即是由Nsp2編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生不連續(xù)2處缺失的高致病性毒株引起的［4］。本試驗(yàn)中HB－Xt1分離株的ORF5和Nsp2蛋白編碼序列與2006年前國內(nèi)流行的經(jīng)典PRRSV CH－1a、BJ－4以及美洲型PRRSV代表株VR－2332株的相似性較低，而與2006年后國內(nèi)流行的高致病性PRRSV的遺傳關(guān)系最近，并且Nsp2蛋白編碼序列內(nèi)也存在兩處不連續(xù)的缺失，故推測(cè)PRRSV HB－Xt1株可能為一株高致病性美洲型PRRSV。關(guān)于該分離株對(duì)豬的致病性需要通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步證明。

PRRSV不同毒株在相同細(xì)胞系上增殖時(shí)的病毒滴度 （TCID50）不盡相同。一般 PRRSV 在MARC－145、CL2621等細(xì)胞系上的 TCID50為105～106［6］。本試驗(yàn)中顯示隨著傳代次數(shù)的增加HB－Xt1分離株在MARC－145細(xì)胞中增殖時(shí)的TCID50逐漸升高，傳至F4～F5代時(shí)達(dá)到106.0TCID50／mL左右，CPE出現(xiàn)時(shí)間也逐漸一致，并且發(fā)現(xiàn)接種病毒后72h時(shí)，TCID50達(dá)到最高值，隨后逐漸降低。此增殖動(dòng)態(tài)與PRRSV感染MARC－145時(shí)依賴細(xì)胞間傳播的方式有關(guān)［7］。因?yàn)镻RRSV感染初期（感染后20～22h）病毒僅在少量細(xì)胞內(nèi)增殖，隨后病毒通過細(xì)胞間傳播方式使多數(shù)細(xì)胞感染，病毒增殖量逐漸增加進(jìn)入對(duì)數(shù)感染期（感染后2～3d），所以在一定時(shí)間內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，病毒滴度逐漸上升。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長，由于受到CPE、細(xì)胞自身的生長周期以及維持液pH值變化等因素的影響，病毒可能死亡，從而導(dǎo)致72h后病毒滴度明顯下降。故選擇 MARC－145細(xì)胞培養(yǎng)PRRSV HB－Xt1株時(shí)，以感染后72h為收獲病毒的最佳時(shí)間。

［1］郭寶清，陳章水，劉文興，等，從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PPRSV 的研究［J］.中國畜禽傳染病，1996，2：1－4.

［2］Chen N，Cao Z，Yu X，et al.Emergence of novel European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mainland China［J］.J Gen Virol，2011，92（Pt 4）：880－892.

［3］Li L，Zhao Q，Ge X，et al.Chinese highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus exhibits more extensive tissue tropism for pigs［J］.Virol J，2012，9：203.

［4］Li B，F(xiàn)ang L，Guo X，et al.Epidemiology and evolutionary characteristics of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China between 2006and 2010［J］.J Clin Microbiol，2011，49（9）：3175－3183.

［5］Ladekj?r－Mikkelsen A S，Nielsen J，Stadejek T，et al.Reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome（PMWS）in immunostimulated and non－immunostimulated 3－week－old piglets experimentally infected with porcine circovirus type 2（PCV－2）［J］.Vet Microbiol，2002，89：97－114.

［6］韋平，秦愛建.重要分子病毒學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：p.389.

［7］Cafruny W A，Duman R G，Wong G H，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）infection spreads by cell－to－cell transfer in cultured MARC－145cells，is dependent on an intact cytoskeleton，and is suppressed by drug－targeting of cell permissiveness to virus infection［J］.Virol J.2006Nov 2；3：90.doi：10.1186／1743－422X－3－90.

［8］Kedkovid R，Nuntawan Na Ayudhya S，Amonsin A，et al.NSP2gene variation of the North American genotype of the Thai PRRSV in central Thailand［J］.Virol J，2010，7：340.doi：10.1186／1743－422X－7－340.

［9］Brar M S，Shi M，Ge L，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Ontario，Canada 1999to 2010：genetic diversity and restriction fragment length polymorphisms［J］.J Gen Virol，2011，92（6）：1391－1397.