雞大腸桿菌毒力因子流行病學(xué)調(diào)查及耐藥性分析

王 娟，黃秀梅，翟海華，蓋文燕，趙思俊，曲志娜，王玉東，王君瑋

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安271000）

大腸桿菌是腸道常駐菌，分布非常廣泛，該菌為條件致病菌。禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的局部或全身性疾病，對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟損失巨大。雞腸道內(nèi)存在著大量的大腸桿菌，有的不能引起發(fā)病，有的則為致病性菌，在一定條件下，可引起雞群發(fā)病。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究表明，一些攜帶新的毒力基因的大腸桿菌可能在動物疾病中具有重要作用，并可能與致病性大腸桿菌的毒力進化密切相關(guān)［1－6］，這為禽大腸桿菌病的防治提出了新的研究課題。為了解我國養(yǎng)雞場大腸桿菌毒力因子的流行狀況，進一步做好大腸桿菌病的防控，本試驗對常見的7種毒力因子進行了檢測和部分抗菌藥物的耐藥性分析。

papC是大腸桿菌P菌毛的亞單位，作為毒力相關(guān)基因，可用來檢測大腸桿菌；形成鐵結(jié)合型復(fù)合物是大腸桿菌攝取鐵的一種機制，鐵結(jié)合型復(fù)合物包括氣桿菌素和腸菌素；iucD參與了氣桿菌素的合成［1］；tsh基因可以表達溫度敏感性血凝素，可能與致病性大腸桿菌的攝鐵能力有關(guān)，也能與粘附作用有關(guān)［2］，Maurer等研究表明，該基因與非致病大腸桿菌無關(guān)［3］；iss基因位于大腸桿菌的ColV質(zhì)粒上，與細(xì)菌抗補體作用有關(guān)；irp2是大腸桿菌毒力島的核心區(qū)基因，可能與其毒力進化有關(guān)［4］。

1 材料

1.1 菌株來源 來自2008年～2012年從河南、山東、安徽、內(nèi)蒙、重慶5個省市養(yǎng)雞場健康雞泄殖腔拭子；參考菌株E.coli O1、O2、O78及金黃色葡萄球菌，為中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心實驗室保存菌株。

1.2 主要試劑 Master Mix美國Promega公司生產(chǎn)；藥敏板天津市金章科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖西班牙Biowest生產(chǎn)；Marker 2000寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；吲哚試劑、M.R.試劑、V－P試劑、三糖鐵瓊脂為北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.3 PCR引物 根據(jù)查閱的資料，設(shè)計7對引物papC、iucD、irp2、tsh、iss、vat以及cva，所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列見表1。

表1 毒力基因的PCR引物序列及產(chǎn)物大小

1.4 質(zhì)控菌株 ATCC25922，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

2 試驗方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定 用滅菌棉棒采集禽泄殖腔拭子后，于運輸培養(yǎng)基運送到實驗室后，接種到麥康凱瓊脂和伊紅美藍瓊脂平板上進行劃線分離，37℃培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落純化培養(yǎng)，純培養(yǎng)物革蘭染色鏡檢。

將營養(yǎng)瓊脂平板上的單個菌落接種于三糖鐵瓊脂、吲哚試驗、V－P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗進行生化鑒定。

2.2 多重PCR方法檢測大腸桿菌毒力因子 （1）模板制備：挑取培養(yǎng)過夜菌落于500μL滅菌超純水中，渦旋均勻后，12 000r／min離心5min，將沉淀懸浮于200μL滅菌超純水中，混勻后置沸水浴中作用10min。取出立即冰浴5min，12 000r／min離心5 min，取上清200μL，于－20℃保存，作為PCR模板備用；（2）25μL反應(yīng)體系：DNA模板，2.0μL；Master Mix，12.5μL；引物，1.0μL；ddH2O，9.5μL；（3）反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，68℃延伸3min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min；（4）PCR 產(chǎn)物電泳鑒定：取PCR產(chǎn)物4μL，用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳，以DNA Marker DL－2 000為參照，溴化乙錠（EB）染色后置紫外燈下觀察。

2.3 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法測定13種抗菌藥物對分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）。對分離菌株根據(jù)凍干型藥敏板說明書進行藥敏試驗，并參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）［7］標(biāo)準(zhǔn)進行結(jié)果判定和質(zhì)量控制。

選擇臨床常用和對公共衛(wèi)生影響較大的8類13種抗菌藥，分別是：青霉素類（氨芐西林、阿莫西林－克拉維酸）、頭孢類（頭孢噻呋）、氨基糖苷類（慶大霉素、大觀霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素、多西環(huán)素）、氯霉素類（氟苯尼考）、磺胺類（磺胺異噁唑、甲氧芐啶－磺胺甲噁唑）、氟喹諾酮類（恩諾沙星、氧氟沙星）、其他（多粘菌素E）。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 從6個省共19個養(yǎng)殖場中，經(jīng)分離鑒定獲得389株大腸桿菌。所有細(xì)菌在麥康凱平板上均生長為表面光滑、邊緣整齊、圓形、隆起的紅色菌落，在尹紅美藍瓊脂平板上為黑色帶金屬閃光的菌落。革蘭染色鏡檢均為兩端鈍圓、形態(tài)均一、中等大小、散在排列的紅色桿菌，初步確定為大腸桿菌。

所有的菌株在三糖鐵瓊脂中為斜面變黃、底部變黃、產(chǎn)氣，均能產(chǎn)生吲哚、M.R.試驗陽性、V－P試驗陰性、不能利用枸櫞酸鹽，證明所分離的細(xì)菌為大腸桿菌。

3.2 毒力因子檢測結(jié)果

3.2.1 毒力因子的多重PCR檢測結(jié)果 將分離菌株提取模板進行papC、iucD、irp2、tsh、iss、vat、cva毒力基因的PCR擴增，同時設(shè)陽性對照和陰性對照。陽性對照和陽性結(jié)果分別擴增出目標(biāo)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，而陰性對照無擴增條帶。見圖1。

圖1 各毒力因子及檢測菌株P(guān)CR擴增結(jié)果

檢測的7種毒力因子中，papC基因陽性67株，陽性率17.22%；iucD 基因陽性226株，陽性率58.10%；irp2 基因陽性94株，陽性率24.16%；tsh基因陽性33株，陽性率8.48%；iss基因陽性153株，陽性率39.33%；cva基因陽性24株，陽性率6.17%；vat基因陽性菌株12株，陽性率3.08%。具體見表1。

表1 各毒力因子在分離菌株中的檢出情況

未檢測到這7種毒力因子的有84株菌，占21.59%；有2株菌含有5種毒力基因，含有4種毒力因子的有17株菌，占4.37%；同時含有3種毒力因子的有55株菌，占14.14%；含有2種毒力因子的有105株菌，占27%，其中iucD＋iss最多。見圖2。

3.2.2 不同區(qū)域間雞大腸桿菌毒力因子流行特點從檢測結(jié)果看出，不同省分離菌株毒力因子的流行情況有所不同。內(nèi)蒙分離菌株中含irp2因子的菌株約占51.6%，而河南只有7.69%的分離菌株含有該因子，其他各省分離菌株占20%左右；河南分離菌株中未發(fā)現(xiàn)含tsh因子菌株，而內(nèi)蒙有16.13%的分離菌株含有該因子；山東和河南有40%以上分離菌株含有iss因子，而其他省約有20%的分離菌株含該因子。

圖2 同時檢出不同毒力因子數(shù)的分離菌株比例

3.3 藥敏試驗結(jié)果 通過對389株分離雞大腸桿菌進行藥敏檢測發(fā)現(xiàn)，分離菌株對選擇的13種藥物的耐藥性非常嚴(yán)重，除多粘菌素E外，對其余12種藥物的耐藥率均超過50%；對青霉素類、磺胺類以及四環(huán)素藥物的耐藥最嚴(yán)重，耐藥率均在80%以上。約70%分離菌株對粘桿菌素E敏感，對氧氟沙星、慶大霉素、大觀霉素、頭孢噻呋和氟苯尼考的敏感菌株占30%左右，對其余藥物的敏感率均比較低。分離的大腸桿菌對13種藥物的耐藥性和敏感性情況見圖3。

圖3 分離菌株對13中抗菌藥的耐藥性和敏感性情況

4 討論

PCR方法用于大腸桿菌毒力因子的檢測具有敏感、特異、快速等優(yōu)點；本試驗通過建立、優(yōu)化檢測大腸桿菌主要毒力因子的多重PCR方法，對山東、河南等6省共19個養(yǎng)雞場的腸桿菌分離株進行了監(jiān)測，這對于科學(xué)防控禽大腸桿菌感染具有積極的意義。

許多研究表明，iucD、papC、irp2是禽源大腸桿菌的重要毒力因子，本試驗結(jié)果也揭示了其在這些地區(qū)雞源大腸桿菌中廣泛存在，證明iucD大腸桿菌是該地區(qū)重要的禽大腸桿菌病病原。許多資料表明，irp2是大腸桿菌的重要毒力因子，在禽源大腸桿菌中亦有報道。本試驗結(jié)果表明，irp2毒力因子菌株（23.91%）與2007年朱善元等［8］的報道（17.4%）相差不大，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2010年陳曉浪等［5］人的報道（71.11%），這可能與本試驗菌株分離自健康動物有關(guān)。有資料表明，papC基因主要出現(xiàn)在O2、O24血清型菌株中［9］，本次檢測中發(fā)現(xiàn)papC的陽性菌株（10.80%）與2007年金文杰等［6］的報道（14%）一致。

本次調(diào)查的禽源大腸桿菌菌株均來自健康動物，藥敏結(jié)果能夠反映部分省區(qū)的臨床用藥情況，總體耐藥情況不容樂觀。由于各種抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，在嚴(yán)重危害動物食品安全的同時，更會導(dǎo)致耐藥菌株數(shù)的迅速增加；尤其廣譜及超廣譜抗菌藥物的不加控制的使用，更可能是造成耐藥菌株大量出現(xiàn)的重要原因。本次調(diào)查可以看出，除了四環(huán)素和磺胺類藥物的耐藥率很高外，對青霉素類和頭孢噻呋等近年廣泛用于臨床的藥物的耐藥性上升非常快，由于很多藥物在人醫(yī)臨床廣泛使用，如不加控制在獸醫(yī)臨床的合理使用，將對人類健康造成影響。

［1］Neilands J.Mechanism and regulation of synthesis of aerobactin in Escherichia coli K12（pColV－K30）［J］.Canadian Journal of Microbiology，1992，38：728－733.

［2］Stathopoulos C，Provence D L，Curtiss R.Characterization of the Avian PathogenicEscherichia coli Hemagglutinin Tsh，a Member of the Immunoglobulin A Protease－Type Family of Autotransporters［J］.Infection and immunity，1999，67：772－781.

［3］Mauer J J BTP，Steffens W L.The receptor in endocrine autoimmunity［J］.Clin Exp Rheumatol，1996，14：7.

［4］Carniel E.The Yersinia high－pathogenicity island［J］.International microbiology：the official journal of the Spanish Society for Microbiology，1999，2：161.

［5］陳曉浪，成大榮，朱善元，等.雞大腸桿菌毒力因子的流行病學(xué)及藥物敏感性分析［J］.揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2010，9：1－6.

［6］金文杰，鄭志明，楊建全，等.禽致病性大腸桿菌分離株中fimC和papC 的檢測研究［J］.中國家禽，2007.29.22：51－54.

［7］Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals（approved standard）［S］.Third edition Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

［8］朱善元，陸輝，王健.禽源大腸桿菌的分離及其毒力因子的檢測［J］.微生物學(xué)報，2007，47（5）：795－799.

［9］Ford B，R6go A T，Ragan T J，et al.Structural homology between the C terminal domain of the PapC usher and its plug［J］.J Bacteriol，2010，192（7）：1824－1831.