比較皮試法與ELISA法在林芝牛結核病檢測中的對比試驗

牛家強，索朗曲扎，徐業芬，拉巴頓珠，李 鵬，2

（1.西藏大學農牧學院動科學院，西藏 林芝860000；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193）

牛結核病是由結核分支桿菌復合群（主要是牛型結核分枝桿菌）所引起的一種人畜共患慢性傳染病，呈世界性分布，被世界動物衛生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，在我國被列為二類動物疫病。目前，發達國家基本上根除或控制了牛結核病，而發展中國家卻呈廣泛傳播與蔓延，我國成為世界上結核病負擔最重的22個國家之一，全球排名第二［1］。近年來，我國結核病的陽性檢出率逐年上升［2］，作為全國五大牧區之一的西藏，由于當地農牧民具有飲生水、飲生牛奶和生食牛肉的習慣，再加上牛羊群散牧，糞便及其他體液污染水源及周圍環境，流動人口的增加及人群密切接觸，使感染結核病的幾率大大增加［3］，很可能是造成該地區結核病流行的主要原因之一。

當前國內外用于牛結核病診斷的方法主要有；根據臨床癥狀和病理變化診斷、細菌分離培養法、結核菌素皮內變態反應（PPD）、淋巴細胞轉化試驗、γ－干擾素試驗和血清學方法等，無論哪種檢測方法都有其優缺點。但比較皮試法（比較結核菌素皮內變態反應）的陽性符合率最高，結果較準確，成為多個國家法定的檢測方法［4］。ELISA檢測法（酶聯免疫吸附試驗）具有方便、快速，高通量、可自動化、特異性強等特點，越來越多地用于牛結核病的檢測中。為了弄清林芝某地牛結核病的感染狀況，進行了以下試驗，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 游標卡尺，1mL一次性注射器，剪毛剪，牛結核菌素ELISA抗原檢測試劑盒、禽型和牛型提純結核菌素液體（國家標準品，5mL／支，100 000IU／mL），均購自中國獸醫藥品監察所。

試驗牛為林芝某村莊散養牛，共計96頭（其中牦牛40頭，犏牛20頭，黃牛36頭）。

1.2 方法 試驗時將96頭試驗牛進行隨機編號，按照先采血后進行PPD試驗的順序進行，并做好詳細記錄。

1.2.1 ELISA試驗

1.2.1.1 待檢血清 試驗牛頸靜脈無菌采血各5 mL，置離心管45°傾斜4℃過夜，然后用移液器小心吸取血清，備用。

1.2.1.2 牛結核菌素ELISA檢測試劑盒 按以下操作步驟進行：（1）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水做30倍稀釋后備用；（2）編號：將樣品與對應微孔按序編號，每板設陰、陽性對照各2孔、空白對照1孔；（3）加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰、陽性對照50μL。在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μL，再加待測樣品10μL，然后輕輕晃動混勻；（4）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min；（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30′后棄去，如此重復5次，拍干；（6）加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外；（7）溫育：操作同4；（8）洗滌：操作同5；（9）顯色：每孔先加入顯色劑 A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min；（10）終止：每孔加終止液50μL，顏色由藍色立轉黃色，即為反應終止；（11）測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.2.1.3 計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.2.1.4 判定標準 試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00；陰性對照孔平均值≤0.15；臨界值（CUT OFF）計算：臨界值＝陰性對照孔平均值＋0.20；陰性判定：樣品OD值＜臨界值（CUT OFF）者為牛結核病抗體（TB－Ab）陰性；陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUT OFF）者為牛結核病抗體（TB－Ab）陽性。

1.2.2 比較皮試試驗 （1）注射部位與術前處理：保定好試驗牛，在其頸部同側中部上1／3處和下1／3處或兩側中部上1／3處分別剪毛，直徑約為10cm。若注射位點位于同側時，上1／3處為牛型結核菌素注射位點，下1／3處為禽型結核菌素注射位點，且間隔約15cm。若注射位點位于兩側時，左右側分別為牛型、禽型結核菌素注射位點，由專人用游標卡尺分別測量兩個注射部位的皮皺厚度；（2）注射劑量與方法：先用75%酒精棉球進行術部消毒，再用1mL注射器分別吸取牛型、禽型結核菌素各0.1mL，然后左手捏起皮膚，右手持針管，將針頭與皮膚成30°～45°角刺入表皮與真皮之間，緩慢注射，以局部形成丘疹狀隆起為準，經72h后再次測量皮皺厚度；（3）結果觀察與判定：注射后72h，仔細觀察牛頸側注射部位局部有無熱痛、腫脹等炎性反應，并由專人用游標卡尺測量皮皺厚度；用牛結核菌素導致的皮厚增加扣除禽結核菌素導致的皮厚增加作為結果判斷標準。若注射部位局部有明顯的炎癥反應，皮皺厚度增加4mm及以上者為陽性；若注射部位局部炎癥反應不明顯，皮皺厚度增加2～4mm者為可疑；若注射部位局部無炎癥反應，皮皺厚度增加2 mm以下者為陰性?？梢膳＝?2d后重復上述試驗，結果仍為可疑及以上者，直接判為陽性，否則為陰性。

2 結果與分析

2.1 比較皮試法與ELISA法的檢測結果 對96頭牛同時應用比較皮試法和ELISA法進行了檢測，結果見表1。從表1可以看出，比較皮試法檢出陽性牛14頭，陰性牛82頭，陽性檢出率為14.58%（14／96）；而ELISA法檢出陽性牛10頭，陰性牛86頭，陽性檢出率為10.42%（10／96）；說明不管那種檢測方法的檢測結果，證明該牛群均為牛結核污染牛群，且比較皮試法的陽性檢出率明顯高于ELISA法，它們之間的陽性符合數為10頭，陽性符合率為83.33%（10／12），表明兩種方法間具有較好的陽性符合率。

2.2 不同牛品種間檢測結果的比對 同時對96頭牛應用比較皮試法和ELISA法進行了檢測，不同牛品種間的檢測結果見表2。從表2可以看出；若以比較皮試法作為金標準時，牦牛的陽性率為15%（6／40），犏牛的陽性率為10%（2／20），黃牛的陽性率為16.67%（6／36）。反之，若以ELISA法作為金標準時，則牦牛的陽性率為10%（4／40），犏牛的陽性率為0%（0／20），黃牛的陽性率為16.67%（6／36）。從而證明該牛群中，結核桿菌黃牛最易感，牦牛次之，犏牛最不敏感。

表1 比較皮試法和ELISA法檢測 （單位：頭）

表2 不同牛品種間運用比較皮試法和ELISA法檢測 （單位：頭）

2.3 比較皮試法與ELISA法兩種檢測方法的比對同時對96頭牛應用比較皮試法和ELISA法進行了檢測，但在兩種檢測方法中，如果以比較皮試法作為金標準，比較皮試法的14頭陽性牛中，ELISA法的陽性符合數為10頭，其敏感性為71.43%（10／14）；82頭比較皮試法陰性牛中，ELISA法試驗檢出的陰性牛為82頭，特異性為100%（82／82），結果見表1。如果以ELISA法作為金標準，ELISA法的86頭陰性牛中，比較皮試法檢出的陰性牛為82頭，特異性為95.35%（82／86），表明兩種方法具有同等良好特異性，但敏感性比較皮試法明顯優于ELISA法。

3 討論與小結

3.1 多數情況下，國內依據結核分支桿菌對結核菌素能產生一種遲發性變態反應，只進行單純的牛型PPD試驗，結果檢出的陽性中包含了非結核分枝桿菌感染，因此，該方法并不理想。本試驗所選用牛結核菌素與禽結核菌素同時做皮內變態反應檢測，用牛型結核菌素導致的皮厚增加扣除禽型結核菌素導致的皮厚增加作為結果判斷標準，其中禽型結核菌素檢測結果代表非結核分枝桿菌感染結果，從而排除了非結核分枝桿菌感染的假陽性結果。因此，比較皮試法的檢測結果比較準確，還具有較高的敏感性和特異性［5］。本試驗在牛結核ELISA陰性牛中，仍檢出了部分牛結核變態反應陽性牛，這說明ELISA試驗并不能檢出所有的結核病牛。我們認為，這是由于結核分枝桿菌在動物體內的細胞免疫和體液免疫分離所造成的，在細胞免疫很強的情況下，體液免疫并不一定很強。

3.2 本試驗中，比較皮試法是檢測細胞免疫的，而ELISA是檢測體液免疫的。當結核分枝桿菌感染動物時，動物機體對結核分枝桿菌的免疫首先是細胞免疫，其次才是體液免疫，這二者是分離的。因為結核分枝桿菌屬于胞內寄生菌，細胞免疫是主要的，只有機體抵抗力弱，病原體向周圍擴散，進入血液和體液中時，才能刺激機體產生大量的抗體［6］。新近感染結核分枝桿菌的牛，其細胞免疫已經開始，但細菌抗原尚不能刺激機體產生強烈的體液免疫；感染過結核分枝桿菌，但機體抵抗力很強時，限制了結核分枝桿菌在體內的增殖、擴散，則體液免疫產生的抗體量很少。此外，非典型分枝桿菌感染及患有寄生蟲病等非特異性因素的干擾，均可引起牛的變態反應陽性，而體液免疫的水平卻很低［7－8］。本試驗中，比較皮試法的陽性檢出率要高于ELISA法，我們認為，這也是它們分別檢測細胞免疫和體液免疫的一個表現［9］。

3.3 本試驗中，比較皮試法的敏感性明顯高于ELISA法，而且它們具有較高的符合率。我們認為，該試驗牛群屬于嚴重結核分枝桿菌感染牛群，由于結核分枝桿菌持續感染，導致機體免疫已由最初的單純細胞免疫很強的階段發展到了細胞免疫與體液免疫并重的階段，導致了本試驗的抗體檢測陽性率高；另外比較皮試法的敏感性高，我們也不排除此試驗中是否存在著一定的非特異性反應。所以應先以比較皮試法檢疫牛群，對陽性牛再用ELISA法檢測，才能達到準確凈化與控制牛結核病的目的。依據主要有：（1）ELISA法檢測陽性的，不管其變態反應陽性還是陰性，都認為是活動型結核，應堅決予以捕殺；（2）比較皮試法陽性而ELISA法陰性的，一般是結核病初期、封閉型結核或非特異性反應。應立即進行隔離飼養或堅決淘汰，并加強ELISA檢測。因為結核病初期、封閉型結核有可能因病情加重或轉化為開放型結核而使抗體檢測轉化為陽性。只要ELISA檢測陽性牛，應堅決予以捕殺，兩種方法有機結合，才能達到凈化與控制牛結核病的目的。

3.4 本試驗是在西藏高原正值枯草的季節進行，試驗牛膘情較差。由于牦牛具有很強的攀爬能力，采食量相對黃牛較高，基本能夠滿足機體之所需，因此，機體狀況較好；而黃牛雖然進行了一定的人工補飼，仍很難維持機體基本需求；犏牛卻遺傳了前兩者的優點，膘情最好。此時一旦接觸結核分枝桿菌，則會立即引起不同程度的免疫反應，也可能是導致出現黃牛的陽性率最高，牦牛次之，犏牛最低的原因之一。

3.5 本試驗的不足之處主要表現為試驗動物數量相對較少，所取得的試驗數據也可能不能完全代表本地牛結核病的實際感染狀況，另外，試驗時期正值枯草季節，導致試驗牛的機體狀況沒有處于同一水平，可能影響試驗結果的準確性，很難充分說明不同動物品種間的敏感性與差異性。另外國外通常撲殺試驗陽性牛，取病變組織或淋巴結進行結核分枝桿菌培養來確診牛結核病。因條件所限，無法培養結核分枝桿菌，所以不能完全確診被檢牛群的陽性牛，只能認為該牛群為結核陽性牛群。

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