豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染抑制肺臟抗菌肽PG－1基因表達

劉春玲，焦慧娟，許美娟，丁志青，李宏全，姜俊兵

（1.山西農業大學動物科技學院，山西 太谷030801；2.山西農業大學生命科學學院，山西 太谷030801）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱為豬藍耳病，該病由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，屬套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬。發病豬主要表現為發熱，出現不同程度的呼吸系統癥狀，豬群免疫功能下降，易繼發感染其他細菌性和病毒性疾病，給養豬生產帶來重大的經濟損失。

豬抗菌肽（Protegrin－1）最初從豬白細胞中分離得到。PG－1僅在豬體內表達，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和產生耐藥性的細菌具有抗菌作用，可降低慢病毒亞科的傳染性和抗囊膜病毒感染。PG－1基因一般在豬的骨髓細胞中表達，以無活性的形式存在于嗜中性粒細胞的分泌性顆粒中，在其mRNA的5＇端有自身的信號肽編碼序列，翻譯后指導嗜中性粒細胞中PG－1的分泌，只有PG－1成熟的C－末端部分經嗜中性粒細胞彈性蛋白酶裂解后才具有抗微生物的活性［1］。發生感染時，細胞因子引起嗜中性粒細胞向感染位置移行，分泌的PG－1等抗菌肽可增強天然免疫反應，并使組織損傷降低到最小程度。Lisanby等人的研究發現，PG－1與其他AMPs具有最高的協同抗微生物作用［2］。PG－1廣譜的抗菌活性已經得到了證實，但PG－1和豬繁殖與呼吸綜合征病毒有何相互影響未見報道，本研究為揭示PRRSV對豬自身抗菌肽基因表達的影響，測定了豬肺臟和小腸中PG－1基因在PRRSV攻毒和對照組的mRNA表達，研究的結果為進一步揭示PRRSV對肺臟組織侵害的分子機理提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物動物模型的建立 隨機挑選6頭20日齡斷奶健康仔豬（購自山西天祿豐種豬育種有限公司養豬場），體重為7.5±1.0kg，室溫飼養，多維飼料飼喂，自由飲水。進行血液檢測，通過豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA試劑盒和檢測試紙檢測血液，抗原結果均為陰性。分圈飼養，每個圈3頭，為正常對照組和PRRSV攻毒組，飼養一周后進行攻毒。依據相關研究的報道［3－5］，我們將攻毒的劑量定為104.0TCID50，口服4mL，肌肉注射2mL，隔天攻毒1次，連續攻毒3次，攻完毒的第7天（仔豬34日齡），取肺臟和小腸組織。試驗所用的PRRSV由江蘇農業科學院贈送。

1.2 感染過程血液中病毒的鑒定 病毒攻毒期間，攻毒2、4、7、9d采血提取血液中的RNA鑒定攻毒是否成功。提取后通過用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測豬血細胞總RNA和PCR擴增產物。攻毒第4天，采血后進行PCR，病毒組電泳后有條帶，證明血液中已有PRRSV感染。PCR產物在196bp左右，經公司測序鑒定產物為PRRSV編碼區DNA片段，表明豬體內含有PRRSV。

1.3 病理組織學檢查 肺部樣品經固定制成鏡檢肺部病理切片，做H.E.染色后對切片用光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.4 肺組織總RNA的提取與合成cDNA 采樣時（34日齡）取肺和小腸組織樣品包在錫箔紙中投入液氮保存。取1g組織樣品按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA。獲得的總RNA經濃度測定和凝膠電泳檢測后用于反轉錄cDNA。首先將RNA濃度歸為同一濃度，反轉錄體系為：RNA 1 μL、Oligo dT 1μL、Buffer 4μL、Enzyme mix 1 1 μL、Oligo dT 1μL，用DEPC水處理的ddH2O補至20μL。反應程序為：37℃30min，85℃5s，產物置－70℃備用。

1.5 熒光定量PCR標準曲線的制備

1.5.1 PG－1基因部分片段的擴增與克隆 利用Primer 3.0軟件設計PG－1 基因（HM371181.1）克隆引物，上游引物：5′－TAGGTTCTGCGTCTGTGTCG－3′，下游引物：5′－AGGTCTCCTTGCTGGGATTT－3′，擴增長度為220bp。再設計得到PG－1熒光定量PCR的特異性引物：上游引物：5′－CGGTTGCGACGGCAGGCTTT－3′，下游引物：5′－ATGGTGCGGGCCGGAAAGGT－3′，擴增長度94bp。熒光定量引物的擴增產物位于以上克隆片段內，均由北京優博基因科技有限公司合成。

20μL PCR反應體系為：10×Buffer 2μL，2.5 mmol／L dNTP 2μL，5pmmol／L上游和下游引物各1μL，Taq酶0.2μL，cDNA 模板1μL，ddH2O 12.8μL。PCR反應程序為：94℃預變性5min→94℃1min→58℃30s→72℃1min，共30個循環；72℃延伸8min，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將純化后產物與pMD18載體連接，轉染感受態細胞DH5α中，按E.Z.A.TM Plasmid試劑盒的使用說明，提取質粒。

1.5.2 測濃度計算質粒拷貝數 由于使用的是小量質粒提取試劑盒，提出來的質粒濃度比較低，采用真空泵，濃縮溶液至60μL。采用核酸測定儀（Biophotometer Plus，Eppendorf）測定質粒濃度后，按以下公式計算質粒拷貝數：

質粒拷貝數（copies／μL）＝6.02×1023（copies／mol）×質粒濃度（g／μL）／質粒分子量（g／mol）；

測得PG－1質粒拷貝數為3.8×1010copies／μL。

1.5.3 標準曲線的建立 （1）將標準質粒用ddH2O進行10倍系列稀釋，分別稀釋成1×1010至1×105copies／μL的6個梯度為模板進行熒光絕對定量PCR；（2）熒光定量PCR體系：模板1μL，熒光定量PCR上、游引物各0.5μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL，ddH2O 10.5μL。PCR反應程序為：95℃30min；95℃10s→60℃30s→72℃30s，40個循環；72℃5min；生成溶解曲線步驟：55℃30 s，每30s升溫0.5℃，81個循環。根據熒光值的變化規律，系統自動生成標準曲線和溶解曲線。

2 結果

2.1 攻毒后臨床癥狀及病理變化 攻毒前后對每頭豬進行體溫檢測。攻毒5d，病毒組3頭豬中有1頭有神經癥狀出現，全身顫抖，攻毒6d，病毒組3頭豬食欲不振，喜臥，都有顫抖癥狀。攻毒9d，全組進食基本廢絕，喜臥，顫抖。對每頭豬進行體溫檢測，結果如表1所示，攻毒組在攻毒后體溫顯著高于空白組（P＜0.05）。

攻毒10d，采樣，剖檢觀察病理變化。病毒組3頭豬剖檢后發現肺部石變，間質性肺炎，肺小葉間質增寬，肺充血并有氣腫。脾臟、腹股溝淋巴結腫大。腎表面有出血點及白色點狀。

表1 攻毒組與空白對照組體溫

2.2 病理切片分析結果 如中插彩版圖1所示，病理切片鏡檢發現攻毒組的肺間質增寬，肺泡被破壞或代償性擴張。脾臟紅髓區脾索溶解，脾竇擴大。這些現象符合PRRSV感染豬肺后的病理變化。

2.3 絕對定量標準曲線 通過Real－time PCR儀擴增，自動檢測出PG－1基因的標準曲線和溶解曲線（圖2）。

圖2中的圓點為10倍梯度的標準品，交叉符號為未知的測定樣品。未知樣品中PG－1基因的拷貝數主要集中在104～106之間。曲線方程為：Y＝3.324 X＋40，決定系數為：R2＝0.994，曲線的擴增效率為：E＝99.9%。這說明在標準質粒稀釋質量濃度范圍內具有良好的線性關系。

圖2 豬PG－1 基因Real－time PCR標準曲線

2.4 PG－1基因在肺臟和小腸中的表達 圖3所示PG－1基因在肺臟和小腸兩個組織中的表達。攻毒組PG－1基因的表達量在這兩種組織中都比未經PRRSV攻毒的對照組攻毒與對照組低。在小腸中，攻毒組PG－1基因的表達量（1.06×105拷貝）低于在對照組中的表達量（1.72×105拷貝），但二者的差異不顯著。在肺臟中，攻毒組PG－1基因的表達量（1.28×105拷貝）顯著低于在對照組中的表達量（3.48×105拷貝），即PRRSV攻毒會顯著降低豬肺臟中PG－1的表達。

圖3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染影響PG－1基因在肺臟和小腸組織中的絕對表達量

3 討論

PG－1是抗菌肽（Protegrins－1）中5位成員之一，它的表達是在骨髓細胞分化的過程中進行的，因此在成熟的嗜中性粒細胞中很難找到它們的mRNA。編碼的Protegrins在信號肽的引導下進入細胞，然后信號肽切除，剩下的部分叫做Proform或者Propeptide。無活性的Propeptide貯存在嗜中性粒細胞中，并隨血流到達身體的各個部位，當動物受到病原微生物刺激或者急性感染時，Protegrins在彈性蛋白酶的作用下，活性的PG就分泌出細胞并發揮免疫作用。抗菌肽主要在豬的骨髓干細胞中表達合成［6］，在肺臟和小腸中GP－1基因的表達尚未見報道。Cheung等人報道了轉PG－1基因鼠在肺臟中PG－1基因的表達研究。該研究分析了野生型小鼠的肺臟中沒有檢測到PG－1基因的表達［7］。在肺臟和小腸中GP－1基因的表達尚未見報道，我們通過常規的基因克隆技術，成功獲得了豬抗菌肽PG－1基因中的特定片段熒光定量PCR的方法，證明PG－1基因在豬的肺臟和小腸組織中均有表達，但不明確該基因在肺臟的何種細胞中表達。

近年來關于PRRSV攻毒的對機體的損害機理及和相關基因表達影響的研究較為深入。Calzada等的研究都證明，PRRSV感染可以抑制IFN基因的表達導致IFN－α蛋白減少［8－9］；Brockmeier等 人應用腺病毒載體在豬肺臟中表達干擾素alpha基因可減輕豬受到PRRSV攻毒的損害［10］；相關研究證明，在肺泡巨噬細胞中Toll樣受體3和干擾素Beta的表達可以抑制PRRSV的感染［11］。Sang等人對抗菌肽在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染時表達變化的研究表明，在MARC－145細胞中PG－4基因的表達可以顯著的抑制病毒的感染［13］，PG－1具有很強的抗細菌活性和中度的抗病毒活性［14］。這些研究均說明PRRSV感染將影響多種相關基因的表達。本研究在測定了該基因在豬感染了PRRSV后，肺臟和小腸組織中的表達量，分析得出PG－1基因在肺臟、小腸組織中有表達，與對照組比較，PRRSV攻毒會顯著降低肺臟中PG－1的表達，而對小腸組織中的表達無顯著影響。試驗證明豬感染PRRSV后，肺臟中抗菌肽PG－1的表達受到了顯著抑制，以致免疫防御能力降低，但具體的作用機制需進一步的探究。

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