新疆沙灣牛病毒性腹瀉病毒基因2型毒株的分離鑒定

王國超，王滬生，喬 軍，孟慶玲，劉昱成，楊海波，賀志昊，陳創夫

（1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子832003；2.新疆沙灣縣獸醫站，新疆 沙灣832002）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬 （Pestivirus）成員，屬內同時還包括豬瘟病毒（CSFV）、綿羊邊界病病毒（BDV）。BVDV主要引起牛的以發熱、黏膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產或產出畸形胎兒為主要特征的一種傳染病。目前，該病在全球范圍內廣泛流行，在養牛業發達的國家更為嚴重。新生牛的持續性感染常年帶毒、排毒，是畜群中主要的傳染源。當持續感染動物再次感染抗原性相關的BVDV時可會引起致死性的黏膜病［1］。同時，BVDV還是牛源生物制品（血清、凍精、胚胎、疫苗等）的潛在污染源，給畜牧業生產和相關產業造成巨大的經濟損失［2－3］。

BVDV基因組為單股正鏈RNA分子，長度約為12.3kb，5′端無“帽子”結構，3′端無Poly（A）“尾巴”結構，病毒基因組由 5′－UTR、開放閱讀框（ORF）和3′－UTR組成［4］。5′－UTR 序列在 BVDV基因組中有較高的保守性，利用此特性可對BVDV的感染進行分子診斷和病原基因分型。目前通常認為，根據其5′－UTR是否存在Pst1位點BVDV可分為兩種基因型，即BVDV－1和BVDV－2，不同的基因型在抗原性上存在較大差異［4］。根據其接種細胞后是否產生細胞病變（CPE），又可以將其分為兩種生物型，即致細胞病變型（CP）和非致細胞病變型（NCP），每種基因型同時存在這兩種生物型，兩種生物型在毒力和致病性方面沒有明顯差別［5］。為了了解在新疆是否同時存在BVDV－1和BVDV－2的感染，本研究對2012年采集沙灣縣某牛場疑似BVDV感染牛的病料進行了BVDV的檢測和分離。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株、毒株及試劑 MDBK 細胞、BVDV NADL標準毒株，購自中國獸醫藥品監察所。宿主菌E.coli DH5α均由本實驗室保存，pMD19－T載體、反轉錄酶 M－MLV及RNA抑制劑，購自TaKaRa公司。1640高糖培養基、犢牛血清（經過BVDV檢測陰性），購自美國GIBCO公司；TRIzol Reagent，購自Invitrogen公司；DNA回收試劑盒、DNA Marker、dNTP和Taq酶，購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 病料采集 從新疆沙灣縣周邊某牛場采集臨床癥狀疑似BVDV感染牛的血液、糞便、腸黏膜、淋巴結、脾臟等病料15份，置于－80℃保存。

1.3 引物設計及合成 根據已經發表的BVDV 5′－UTR序列和E2基因序列選擇相對保守區域分別設計3對特異性引物，其中P1－P2用于篩查疑似病料是否為BVDV陽性，P3－P4和P5－P6分別用于BVDV基因1型和基因2型E2基因的擴增。引物及測序服務由北京華大基因公司完成。P1：5′－CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT－3′；P2：5′－GGAACTCCATGTGCCATGTACA－3′。E2基因引 物 P3：5′－GGGCCAGCCTTCCAGATGGT－3′；P4：5′－TCCCCCTTTAACATGTATTG－3′。 P5：5′－GGGCCAGCCTTCCAGATGGT 3′；P6：5′－TCCCCCTTTAACATGTATTG－3′。

1.4 RT－PCR擴增及5′－UTR的克隆 參照 TRIzol說明操作提取病料總RNA，以提取的RNA為模板進行RT反應，再以RT產物為模板進行5′－UTR PCR檢測。RT反應采用20μL反應體系：M－MLV 5 ×Buffer 5μL，dNTP（2.5μmol／L）4 μL，下游引物（20pm）1μL，RNase inhibition 1μL，M－MLV reverse enzyme 1μL，RNA－free Water 8 μL，20μL體系，混勻37℃反轉錄1h。以RT產物為模板，采用50μL反應體系進行PCR擴增：10×Buffer 5μL，cDNA 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq酶0.5μL，H2O 33.5μL。PCR反應條件為：95℃預變性4min；94℃變性50s，58℃退火40s，72℃延伸30s，40個循環；72℃延伸10min。將PCR擴增用DNA凝膠回收試劑盒回收后與載體pMD19－T連接，通過PCR和酶切進一步篩選驗證陽性克隆。將鑒定正確的重組載體送北京華大基因公司測序；用DNAMAN軟件對測序進行分析。

1.5 病毒的分離鑒定

1.5.1 樣品的處理 對于RT－PCR檢測陽性的組織病料，加入4體積的PBS緩沖液研磨，以12 000 r／min（4℃）離心15min。吸取上清液，按0.1%體積加入雙抗，混勻在4℃作用過夜，12 000r／min（4℃）離心15min吸取上清，0.22μm濾膜過濾，－80℃保存用于病毒的分離。對于RT－PCR檢測陽性的血液樣品用淋巴細胞分離液無菌分離外周血單核細胞（PBMC），吸取后置于1640培養液中待用。

1.5.2 病毒分離 將長成單層的MDBK細胞用PBS沖洗3遍，將處理好的病料上清液或PBMC接種MDBK單層細胞，置于37℃、5%CO2吸附2h，然后加入1640細胞維持液（含2%犢牛血清），每日觀察細胞3次，同時設立正常細胞和接種NADL毒株細胞作對照。連續盲傳5代，觀察是否出現細胞病變（CPE）。待出現CPE時，反復凍融3次后，培養液用2%磷鎢酸負染后電鏡觀察。

1.5.3 BVDV－SW 分離株 E2基因的擴增、克隆、遺傳進化分析 用TRIzol提取BVDV－SW 株總RNA，分別用BVDV基因1型和基因2型E2基因特異性引物P3－P4和P5－P6進行PCR擴增。PCR反應條件均為：95℃預變性4min；94℃變性40s，52℃退火50s，72℃延伸90s，40個循環；72℃延伸10min。將擴增出來的目的片段回收后與pMD19－T載體連接，轉化克隆后挑取單菌落，做菌液PCR篩選，篩選陽性轉化子進行測序分析。用MEGA5.0軟件（Phylogeny／Bootstrap test of phylogeny／neighbor－joining，Bootstrap 重 復 次 數 為1 000次）構建E2基因的遺傳進化樹。

2 結果

2.1 病料檢測結果 利用5′－UTR引物對15份病料進行RT－PCR檢測，結果有4份樣品（其中2份為糞便樣品，2份為血液樣品）擴增出與預期值相符的293bp的目的片段（圖1）。目的片段克隆入T載體后，用PCR方法篩選重組菌（圖2）并進行測序，結果從樣品擴增出的5′－UTR 與 BVDV－2 5′－UTR同源性為99.2%，證實疑似病料確實屬于BVDV感染。

圖1 5′UTR PCR擴增

圖2 陽性重組菌液的PCR鑒定

2.2 病毒分離結果 當盲傳傳至第4代時，MDBK出現規律性的細胞病變（CPE）（圖3），主要表現為：梭狀或三角狀細胞開始變圓，部分細胞開始脫落，漂浮在維持液中；在瓶壁上呈現拉網狀，胞漿中出現大小不等的空泡，細胞碎片漂浮在液面上。在產生細胞病變的培養液負染后電鏡觀察到球形、有囊膜、直徑約為50～60nm、囊膜表面有突起的病毒粒子，形態結構與BVDV顆粒相符（分離株命名為BVDV－SW）。

圖3 BVDV－SW分離株在MDBK細胞上引起的細胞病變

2.3 BVDV－SW分離毒株E2基因的擴增、克隆與序列分析 測序結果分析顯示，BVDV－SW分離株E2基因與NADL（屬于BVDV－1）參考株的同源性為67.05%，與BVDV890、XJ－04參考株同源性分別為82.36%和84.36%，經過Nucleotide blast分析后，與BVDV－2型同源性比較高，屬于BVDV－2型。

圖4 E2基因PCR擴增

2.4 BVDV E2基因系統進化分析 將分離株BVDV－SW的E2蛋白基因與GenBank發表的BVDV基因1型標準毒株和基因2型標準毒株及其他參考毒株進行系統進化樹分析（圖6），結果顯示：進化樹明顯分成兩個分支，分離株BVDV－SW 和17237（BVDV－2型，分離于歐洲）聚為一個小分支，與C24V、NADL（均屬于BVDV－1型）標準株的親緣關系均較遠；BVDV－SW與XJ－04毒株關系較近，同源率較高。

圖5 E2基因重組菌液的PCR鑒定

圖6 基于BVDV E2基因的系統進化分析

3 討論與小結

近年來，隨著新疆畜牧業的快速發展，BVDV在動物血清中陽性率較高。王治才等對新疆7個地區羔羊作了BVDV的感染調查，平均陽性率為73.6%［6］。鐘發剛等通過對2006年～2008年新疆7個地區15個牛場472份全血樣品進行了RTPCR檢測，發現42%的樣品為陽性［7］，證實該病在新疆牛羊中廣泛流行。為了科學防控本病，目前有必要開展該病的分子流行病學調查和病原的分離鑒定研究。

用于BVDV的分離的病料可采用疑似BVDV感染牛的血液、糞便、腸黏膜、淋巴結和脾臟等［8］。本研究發現，采用發病牛血液從中分離出外周血單核細胞（PBMC）較易分離出BVDV。在發病牛糞便中雖然可以檢測到大量的病毒粒子，但由于糞便中存在有毒物質，會影響細胞形態結構，易造成CPE假象，所以糞便樣品適合作為RT－PCR檢測對象而不適合作為分離病毒的材料。另外，有研究證實牛源細胞、血清及其相關制品、凍精本身存在BVDV污染，因此在分離BVDV時要先檢測分離所用的細胞和血清本身是否存在BVDV污染［9］。

現有的研究資料顯示，目前國內分離鑒定的毒株以BVDV－1占優勢地位，BVDV－2流行較少，而BVDV－2主要流行于南美、北美以及一些歐洲國家。然而隨著國際畜禽貿易活動的增加，近幾年亞洲國家也分離到了一些 BVDV－2流行毒株［10－12］，我國也有分離到 BVDV－2毒株的報道［13－14］。鐘發剛等通過對新疆7個地區472份全血樣品中RT－PCR檢測為陽性的24份樣品擴增出的5′－UTR測序比較發現，BVDV流行株基因型主要為BVDV－1b（18份）和BVDV－1c（6份），而沒有檢測到BVDV－2的感染［7］。然而，本研究證實目前在新疆某些奶牛場牛群中存在BVDV－2感染，并且流行毒株具有較強的致病力，推測這可能與近幾年日益頻繁的國內外畜禽貿易活動有關。本研究為新疆奶牛BVDV的科學防控提供了一定的理論依據。

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