傳染性囊病病毒感染對(duì)SPF雛雞免疫器官免疫功能的影響

王靈娟，高雪麗，隋 欣，于志強(qiáng)，李博韜，鄭世民

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

傳染性囊病（IBD）是由傳染性囊病病毒（IBDV）引起的3～12周齡雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染性疾病，其中3～6周齡雞最易感。IBDV主要侵襲雞和火雞的中樞免疫器官－腔上囊，在含有IgM的B淋巴細(xì)胞中復(fù)制，引起雛雞腔上囊淋巴細(xì)胞壞死和淋巴濾泡缺失，腔上囊萎縮，導(dǎo)致雛雞體液免疫功能顯著降低［1］。T淋巴細(xì)胞雖然不是IBDV復(fù)制的主要靶細(xì)胞，但病毒感染雛雞后，其細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答也在一定程度上也受到損害，因此，IBDV 感染后雛雞的體液免疫和細(xì)胞免疫功能均下降，引起雞體免疫功能障礙，致使感染雛雞對(duì)各種疫苗的免疫應(yīng)答效應(yīng)降低甚至失敗，誘發(fā)多種疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失［2］。本試驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和MTT及免疫組織化學(xué)方法對(duì)SPF雛雞人工感染IBDV后，其免疫器官的T、B淋巴細(xì)胞增殖功能和腔上囊、脾臟中IgG、IgA、IgM生成細(xì)胞數(shù)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了較系統(tǒng)的檢測(cè)，為進(jìn)一步探討IBDV感染對(duì)雛雞免疫器官的體液免疫和細(xì)胞免疫影響，并闡明其發(fā)生機(jī)制提供了科學(xué)試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21日齡CSIRO－MVS品種SPF雛雞100只，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF雛雞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并提供飼養(yǎng)。

1.2 IBDV毒株 IBDV強(qiáng)毒（J1C7）株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要試劑 刀豆蛋白A（ConA）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、脂多糖（LPS）均為Sigma公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）為 Amresco公司產(chǎn)品；RPMI1640為GICBO公司產(chǎn)品；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、處理及被檢材料采取 100只21日齡SPF雛雞隨機(jī)分為病毒感染組（I組）和對(duì)照組（C組）。其中I組雛雞經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼感染IBDV稀釋液0.1mL／只；C組雛雞經(jīng)上述相同途徑應(yīng)用等量高壓滅菌的PBS。兩組雛雞分別于感染后1、3、5、7、14d和28d，每組隨機(jī)抽取5只雛雞心臟采血處死，快速采取腔上囊、脾臟和胸腺，做相應(yīng)處理，供各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)使用。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.5.1 T、B淋巴細(xì)胞增殖功能的檢測(cè)，采用細(xì)胞培養(yǎng)及MTT檢測(cè)法。

1.5.2 IgG、IgM、IgA 生成細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)，采用組織切片及免疫組織化學(xué)染色法。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，比較兩組間差異，結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBDV感染對(duì)SPF雛雞免疫器官T、B淋巴細(xì)胞增殖功能的影響

表1 IBDV感染SPF雛雞胸腺和脾臟T細(xì)胞增殖功能的動(dòng)態(tài)變化 （590nm OD值）

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞增殖功能均于病毒感染后3～7d明顯低于對(duì)照雛雞（P＜0.05），其余雖然病毒感染雛雞較對(duì)照雛雞有所降低，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

表2 IBDV感染SPF雛雞腔上囊和脾臟B淋巴細(xì)胞增殖功能的動(dòng)態(tài)變化

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊和脾臟中B淋巴細(xì)胞增殖功能于病毒感染后3～28d極顯著降低（P＜0.01），其余未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

2.2 IBDV感染對(duì)SPF雛雞腔上囊和脾臟IgG、IgM、IgA生成細(xì)胞數(shù)量的影響。

表3 IBDV感染雛雞腔上囊抗體生成細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化 （×103個(gè)／mm2）

表4 IBDV感染雛雞脾臟抗體生成細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化 （×103個(gè)／mm2）

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊中IgG、IgA、IgM生成細(xì)胞數(shù)均于病毒感染后1～28d均不同程度的低于對(duì)照雛雞，其中IgG生成細(xì)胞數(shù)量在感染后3～28d極顯著降低（P＜0.01），IgA和IgM生成細(xì)胞數(shù)均于感染后5～14d顯著或極顯著低于對(duì)照雛雞（P＜0.05或P＜0.01）（表3）。

21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其脾臟IgG、IgA、IgM生成細(xì)胞數(shù)量均于感染后的28d內(nèi)低于對(duì)照雛雞，其中IgG生成細(xì)胞數(shù)于感染后3～7d顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），IgA、IgM生成細(xì)胞數(shù)量于感染后3～14d明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）（表4）。

3 討論

細(xì)胞免疫主要是T淋巴細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，T細(xì)胞在胸腺內(nèi)分化成熟并隨血液流動(dòng)至外周淋巴器官的特定部位，發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，因此，T細(xì)胞增殖功能反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。T淋巴細(xì)胞成熟的特征之一，是對(duì)有絲分裂原，如植物凝集素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）等刺激呈現(xiàn)分裂增殖反應(yīng)［3］，因此，在適宜條件下，通過(guò)有絲分裂原誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的胸腺、脾臟和腔上囊細(xì)胞的增殖反應(yīng)是研究淋巴細(xì)胞分化發(fā)育、免疫功能調(diào)節(jié)的方法之一。據(jù)報(bào)道，SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊、脾臟、胸腺以及盲腸扁桃體等免疫器官組織受損，對(duì)其所含的T淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能影響顯著［4－5］。肖琛聞等［6］報(bào)道，雛雞感染IBDV后3～5d，脾臟和外周血T淋巴細(xì)胞增殖功能顯著降低，隨后T淋巴細(xì)胞增殖功能又逐漸恢復(fù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，21日齡SPF雛雞胸腺和脾臟T淋巴細(xì)胞增殖功能于IBDV感染后3～7d顯著降低，后期逐漸恢復(fù)，此研究與肖琛聞等人報(bào)道基本一致。IBDV感染雛雞，其T淋巴細(xì)胞增殖功能降低的原因是，雛雞感染IBDV后，巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌IL－2的量降低，不能發(fā)揮直接或間接活化T細(xì)胞的功能，使其增殖功能降低；一些具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的因子，如IFN－α、β、IL－6和IL－8等能夠增加感染IBDV后雛雞組織的壞死程度，致使淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能降低；IFN－γ刺激巨噬細(xì)胞釋放NO抑制淋巴細(xì)胞增殖功能［7］。

體液免疫主要由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，當(dāng)外界抗原刺激時(shí)，B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生和分泌特異性抗體，發(fā)揮體液免疫作用。禽體內(nèi)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體主要有IgA、IgM和IgG 3種，具有阻止外來(lái)抗原、異物傷害的作用。IBDV的主要靶器官是腔上囊，其中B細(xì)胞對(duì)IBDV最敏感，帶有sIgM的B細(xì)胞為IBDV的重要靶細(xì)胞，除腔上囊外，IBDV對(duì)其他富含B淋巴細(xì)胞的組織器官，如脾臟等，也具有很強(qiáng)的攻擊性，可造成淋巴細(xì)胞受損，細(xì)胞凋亡，甚至壞死等。IBDV多種蛋白如VP2、VP5均能引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞凋亡，使?jié){細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化受阻，抗體的合成及分泌減少，機(jī)體體液免疫受抑制［8－9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，1日齡雛雞感染IBDV后1～6周，腔上囊和脾臟中漿細(xì)胞數(shù)量和IgA、IgM和IgG含量均顯著低于對(duì)照雛雞［10］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，21日齡SPF雛雞感染IBDV后，其腔上囊和脾臟中B細(xì)胞增殖功能和IgA、IgM和IgG生成細(xì)胞數(shù)均于病毒感染后1～28d低于對(duì)照雛雞；并且，腔上囊和脾臟中B淋巴細(xì)胞增殖能力變化與IgA、IgM和IgG生成細(xì)胞數(shù)量變化相一致，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，其可能原因?yàn)椋r雞感染IBDV后，B細(xì)胞數(shù)量減少，增殖功能降低，導(dǎo)致漿細(xì)胞數(shù)量減少，分泌相應(yīng)抗體下降，體液免疫功能降低。由此可見(jiàn)，SPF雛雞感染IBDV后，引起感染雛雞體液免疫功能下降，導(dǎo)致雛雞抗病能力降低。

綜上可見(jiàn)，B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫與T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫共同參與IBDV的免疫致病過(guò)程，并且IBDV具有抑制雛雞體液免疫和細(xì)胞免疫的功能，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞增殖功能和抗體生成量降低的持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于T細(xì)胞增殖功能的抑制時(shí)間，表明IBDV感染雛雞體液免疫的損害重于細(xì)胞免疫。

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