利用酵母雙雜交系統篩選與牛MSTN相互作用蛋白

趙 靜，王 軍，陳 洋，鄭立雙，孫城濤，呂文發

（1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春130118；2.遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧 錦州121001）

肌肉生成抑制素（MSTN）屬轉化生長因子－β（TGF－β）超家族成員，是骨骼肌發育的負調可溶性mystatin節因子［1－3］。在哺乳動物體內，MSTN 能夠抑制肌細胞的增殖和分化［4－6］。目前有研究發現，受體、myostatin前肽、卵泡抑素及其相關多肽和蛋白質、myostatin阻斷抗體、RNA干涉及其他一些化學抑制劑［2］，通過主動免疫方式抑制MSTN前體蛋白成熟化，從而抑制活性MSTN蛋白二聚體的形成，最終抑制MSTN的生物活性，從而導致肌肉的快速增長，但是有關體內MSTN生物學功能的調控機制目前還未闡明。蛋白質是細胞活性及功能的最終執行者，研究MSTN相互作用蛋白不僅對闡明MSTN的調控機制具有重要意義，而且也為開發MSTN功能調控技術和產品提供新的方向。酵母雙雜交系統是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術，可以高通路的篩選細胞內相互作用蛋白，是發現相互作用新蛋白的一種強有力的手段［7，9］。本試驗利用酵母雙雜交技術對牛MSTN相互作用蛋白進行了篩選并應用免疫共沉淀技術對篩選蛋白進行體內驗證，為闡明MSTN生物學功能的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 大腸桿菌KC8，酵母菌Y2HGold，pGEX－4T－l和pcDNA 3.0－Flag載體均由本實驗室保存；pGBKT7和pGADT7質粒、酵母雙雜交系統Make Your Own“Mate ＆ Plate”Library System（Cat.No.630490）試劑盒，購自Clontech公司；酵母培養基所需各種氨基酸，購自美國Amresco公司；人胚胎腎細胞（293T）由本實驗室保存，抗Flag標簽的單克隆抗體偶聯的瓊脂糖凝膠珠（anti－Flag M2－Agarose）等，購自Sigma公司；轉染試劑Lipofectmine2 000，購自Invitrogen公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 誘餌質粒的構建及自激活和毒性檢測 根據GenBank上公布的牛MSTN成熟片段mRNA序列設計引物，上游引物引入ECORⅠ酶切位點：5′－TCGGAATTCGATTTTGGGCTTGATTGTGAT－GAAC－3′，下 游 引 物 引 入 PSTⅠ 酶 切 位 點：5′－CGCTGCAGTCATGAACACCCACAGCGATC－3′，對pMD18－T－MSTN重組載體和pGBKT7質粒進行雙酶切，利用SolutionⅠ連接液定向連接，構建pGBKT7－MSTN誘餌質粒，對獲得的重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程技術服務有限公司測序分析比對。將構建好的含誘餌載體pGBKT7－MSTN的Y2HGold酵母菌作為試驗組，含載體pGBKT7－53的Y2H酵母菌作為陽性對照組，空Y2HGold酵母菌作為陰性對照組，涂布接種于 SD／－Trp－His、SD／－Trp－Leu、SD／－Trp／－Leu／－Ade／－His平板上，30℃倒置培養3～5d，觀察菌落的生長情況。再分別將轉有空載體pGBKT7的Y2H酵母菌和試驗組接種于SD／－Trp的液體培養基中過夜振蕩培養，用紫外分光光度計測量其OD600值。

1.3 牛肌肉cDNA文庫的篩選 挑取在SD／－Trp固體培養基上生長大于2mm含有pGBKT7－MSTN質粒的Y2HGold酵母菌落，接種于SD／－Trp液體培養基中，30℃振蕩培養16h～24h，當OD600值達到0.8時，與含有牛肌肉cDNA文庫的Y187酵母菌交配融合，交配18h～24h后，觀察交配情況，離心收集菌液，將菌液用玻璃珠涂布于SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade平板上初步篩選陽性克隆，30℃倒置培養3～8d。同時取樣品100μL梯度稀釋濃度分別為：10－1、10－2、10－3、10－4；分別涂布在SD／－Trp，SD／－Leu，SD／－Trp－Leu平板上計算融合效率。

1.4 文庫陽性克隆的鑒定分析 初步篩選的陽性克 隆 劃 線 于 SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade 平 板 上，30℃倒置培養3～8d。挑取生長旺盛的菌落進行PCR鑒定，將PCR鑒定成功的菌落接種于SD－Leu液體培養基中并提取質粒，將提取的質粒轉化大腸桿菌KC8送上海生工生物工程技術服務有限公司測序并將質粒回轉酵母驗證，測序結果與NCBI數據庫比對、分析。

1.5 免疫共沉淀 將293T細胞在37℃5%CO2培養箱中培養，待細胞長到90%～95%融合度時開始轉染；在轉染前1天，將細胞傳代至直徑6cm細胞培養板上。每孔加不含抗生素培養基DMEM 2 mL，將準備好的滅菌的蓋玻片放入培養孔里，取構建成功的pLEGFP－MSTN 與pcDNA 3.0－Flag－T－cap重組質粒各5μg加入到250μL的DMEM（無血清、無抗生素）中為溶液1，再取同樣的250μL的DMEM加入10μL lipofectamineTM2 000混勻，室溫靜置5min為溶液2，將溶液1和溶液2混合，室溫條件下靜置30min；將混合均勻的溶液1與溶液2逐滴加入孔中，輕輕混勻，于5%濃度的CO2培養箱中37℃條件下培養，6h后換液，繼續培養18h～42 h；收細胞，用預冷的PBS洗2次，用1mL PBS懸浮細胞至1.5mL的離心管中，2 500r／min離心5 min，留上清；加500μL細胞裂解液裂解細胞；小探頭超聲細胞裂解液后，12 000r／min（4℃）離心10 min，取含相等量蛋白的上清加入25μL抗Flag標簽的單克隆抗體偶聯的瓊脂糖凝膠珠懸液中，4℃緩慢搖晃孵育過夜，回收凝膠珠，再用裂解液洗滌3遍以上凝膠珠，在4℃條件下旋轉孵育5h，3 000r／min（4℃）離心5min，將上清小心吸去，最終沉淀用20μL 2×SDS上樣緩沖液懸浮煮沸10min，12 000 r／min離心1min。用抗GFP和Flag標簽蛋白的兩種單克隆抗體進行免疫印跡分析（Westem－blot）。

2 結果

2.1 誘餌質粒pGBKT7－MSTN構建及自激活和毒性檢測分析 以pGBKT7－MSTN質粒為模板做PCR，并做雙酶切獲得7 600bp載體片段和330bp目的片段（見圖1），送上海生工生物工程技術服務有限公司測序結果正確，表明pGBKT7－MSTN誘餌重組質粒構建成功。將含有誘餌質粒的pGBKT7－MSTN的 Y2HGold酵母菌 涂布在 SD／－Trp－His、SD／－Trp－Leu、SD／－Trp／－Leu／－Ada／－His平板培養基上都無菌落生長，且陽性對照組出現菌落，說明誘餌蛋白不能自激活。將試驗組與轉有空載體pGBKT7的Y2HGold酵母菌分別接種于SD／－Trp液體培養基中30℃振蕩培養過夜后，OD600值分別為0.813和0.809無明顯差別，說明構建的誘餌蛋白對宿主酵母菌無毒性。

2.2 陽性克隆篩選 酵母融合18h～20h后，取1滴菌液于載玻片上，置于倒置顯微鏡下觀察細胞，酵母出現了三葉草狀二倍體融合細胞，說明雜交融合成功。4個稀釋度分別涂布接種于SD／－Trp、SD／－Leu、SD／－Trp／－Leu平板上，按照公式：融合率 ＝（SD／－Trp／－Leu菌落數）／（SD／－Trp和 SD／－Leu中較少的菌落數）計算融合率為16%，符合文庫篩選要求。篩選出的陽性克隆在SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade平板上反復篩選3次，得到3個陽性克隆，將這3個陽性克隆進行回轉驗證，得到一個陽性克隆（圖2），再將得到的陽性克隆轉入大腸桿菌中進行測序分析，與NCBI GenBank數據庫進行BLAST比對，發現該基因與家牛titin－cap蛋白同源性高達99%，GenBank登錄號為NM＿001014915.1。

圖1 誘餌重組質粒pGBKT7－MSTN

圖2 酵母雙雜交分析陽性克隆

2.3 通過免疫共沉淀驗證MSTN和T－cap在體內的相互作用 用抗Flag抗體偶聯的瓊脂糖珠子結合，免疫沉淀帶有Flag標簽的T－cap，再用GFP抗體做 Western－blot分析，檢測免疫沉淀物中是否有GFP－MSTN。結果如圖3，MSTN和T－cap可以在哺乳動物細胞中特異的結合，而GFP不會與T－cap結合。結果證明，MSTN和T－cap能夠在哺乳動物細胞中特異的結合。

3 討論

MSTN是近年來發現的一個重要的肌細胞生長調控因子，其主要功能是負向調控肌細胞生長發育，對該基因的進一步研究發現，有兩種雙肌牛骨骼肌中編碼肌生成抑制素的遺傳密碼發生了突變［，9］，用基因打靶敲除GDF－8基因，制備了基因缺失小鼠，其骨骼肌的重量是普通小鼠的2～3倍以上［10］。因此通過抑制MSTN活性來增加畜禽肌肉量及在醫學上的疾病治療將是一個非常重要的研究。有研究發現，相互作用蛋白之間能夠結合形成復合物，使某一蛋白處于非活性狀態，因而從相互作用蛋白角度研究MSTN，能為MSTN生物學功能的調控打開新的思路。

酵母雙雜交系統是研究蛋白質－蛋白質相互作用的一項有效技術，使用此種方法可以篩選與某一已知蛋白質或結構域發生相互作用的新成員。本研究利用酵母雙雜交體系從牛肌肉cDNA中篩選與MSTN相互作用的蛋白，經2輪嚴格篩庫，排除了假陽性，得到3個陽性克隆，經測序分析blast比對證實為1個基因，其余為相同序列或同源性較接近序列。本研究也通過免疫共沉淀技術對MSTN與T－cap進行相互作用驗證，排除酵母雙雜交存在的假陽性可能。

對篩選得到的MSTN相互作用蛋白進行功能分析，T－cap是一個19kDa的肌蛋白，最初被確定在骨骼肌中含量最為豐富［11］。據報道，T－cap在肌原纖維生成和肌纖維翻轉過程中參與細胞骨架重組［12］，表明它在肌節蛋白的結構融合中起重要作用，是肌節的結構完整性所必要的［13］，有研究結果表明，T－cap在Z－拉鏈區域內起著連接肌原纖維與肌原纖維膜的作用［14］。MSTN蛋白以自分泌方式依賴劑量效應對肌纖維的增長分化起抑制作用。Zheng等［15］在C2C12成肌細胞中過度表達 T－cap蛋白，成肌細胞中 MSTN的濃度非常低，說明T－cap蛋白對MSTN起到一定的抑制作用。綜上所述，本研究發現的T－cap蛋白能夠抑制 MSTN功能，但這個蛋白是如何與MSTN發生相互作用，通過什么機制來發揮作用，還需進一步研究。

4 結論

本試驗中，我們利用酵母雙雜交技術篩選出與牛MSTN有相互作用的T－cap蛋白，并通過免疫共沉淀試驗驗證了二者之間存在相互作用，為探索MSTN蛋白功能和作用機理提供了新的方向。

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