牛A型多殺性巴氏桿菌分離株的鑒定和免疫原性研究

汪 漫，胡長敏，陳穎鈺，彭清潔，姜 鵬，崔 鵬，陳煥春，郭愛珍

（1.華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢430070；2.華中農業大學動物醫學院，湖北 武漢430070；3.華中農業大學動物科技學院，湖北 武漢430070；4.武漢科前動物生物制品有限公司，湖北 武漢430070）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）最早發現于1881年，被認為與多種野生和家養動物的重要疾病相關。多殺性巴氏桿菌的莢膜結構和脂多糖成分是細菌血清群和血清型分類的基礎［3］。被動血凝和凝膠擴散沉淀試驗［4］將多殺性巴氏桿菌分為5個莢膜型（A，B，D，E，F）和16個血清型（1～16）［5］。2001年，Townsend等針對莢膜基因設計的多重PCR，能將A，B，D，E和F五種莢膜型有效區分開來［6］。A型是牛呼吸系統疾病綜合征（bovine respiratory diseases，BRDs）的主要原因之一，主要導致肺炎癥狀［1］；而B和E群則主要導致非洲和亞洲地區的牛和水牛出血性敗血病（簡稱牛出敗）［2］。

牛呼吸系統疾病綜合征是肉牛運輸后發生的主要疾病，以肺部病變為主，發病率和致死率很高，近年來給我國肉牛養殖業帶來重大損失。病原學調查表明，臨床上A型多殺性巴氏桿菌常與牛支原體混合感染［7］，導致疾病治療和預防的復雜化。本實驗室自2009年至2010年間從不同地區牛場臨床發病牛的肺組織中分離到4株Pm，初步確定為A型Pm，均為與牛支原體混合感染菌，表明控制A型Pm感染將有利于控制牛呼吸系統疾病綜合征。本研究對該4株菌進行了細菌學特征鑒定、小鼠毒力試驗、免疫和攻菌保護試驗，旨在為進一步研發滅活疫苗篩選制苗菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株 4株多殺性巴氏桿菌臨床分離株，由本實驗室從河南省駐馬店某牛場和湖北省洪湖、黃岡、鐘祥等3地的牛場病牛肺組織中分離，編號分別為ZMD、HH、HG和ZX，由本實驗室保存。A型Pm參考 菌 株 （CVCC390）、B 型 Pm 參 考 菌 株（CVCC391）、D 型 Pm 參考菌株（CVCC392）、E型Pm參考菌株（CVCC393）和F型Pm參考菌株（CVCC394），購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 細菌培養鑒定 TSA（Tryptic Soy Agar），TSB（Tryptic Soy Broth），均購自Bacto公司；牛血清，購自杭州四季青材料有限公司；微量生化鑒定試劑、革蘭快速染色試劑，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

將分離株接種于含4%血清的TSA平板和綿羊全血TSA平板上，37℃培養16h～24h后觀察菌落形態。將菌落涂片，分別進行革蘭和瑞氏染色，鏡檢。在無菌操作臺上，用接種環分別挑取單菌落，接種于蔗糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、衛矛醇、山梨醇、甘露醇、靛基質、枸櫞酸鹽、O－F發酵管、硫化氫、尿素、硝酸鹽等微型生化鑒定管，按廠家說明書操作和觀察結果。將分離株接種于含4%血清TSB中，180r／min搖床培養12h～18h，進一步將培養物1∶100轉接至100mL含4%血清的TSB中，每隔2h吸取1mL菌液，10倍遞增稀釋后，接種TSA平板，37℃培養16h～24h后進行菌落計數，繪制生長曲線。

1.3 PCR鑒定及分型 DNA ladder為寶生物工程（大連）有限公司產品；EasyTaq PCR SuperMix為北京全式金生物技術有限公司產品。參考Townsend等報道方法，將疑為Pm的分離菌株進行多重PCR擴增，目的基因為Pm的KMT1基因、A型Pm的hyaD－hyaC基因、B型Pm的bcbD基因、D型Pm的dcbF基因、E型Pm的ecbJ基因和F型Pm的fcbD基因［6］。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。序列如表1。

表1 Pm種型鑒定引物序列

取分離株TSA平板生長菌落，用20μL無菌超純水稀釋，作為PCR模板。25μL PCR反應體系組成如下：10μmol／L上、下游引物各0.8μL（共6對引物），2×Easy Taq PCR SuperMix 10μL，無菌水2.4μL，模板3μL。PCR反應條件：94℃變性10 min；然后進入30個循環，94℃1min，56℃1min，72℃1min；最后72℃延伸10min，PCR產物4℃保存，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 毒力比較 取18～22g健康雌性SPF昆明系小鼠126只（購自武漢大學動物實驗中心），分為4組，每組30只，另設生理鹽水空白對照6只。將4株分離株分別接種于含4%血清的TSB中培養至對數生長期，分別以滅菌生理鹽水稀釋至含菌量為10、30、100、300、1 000CFU／0.1mL后接種小鼠，0.1mL／只，每個分離株的各稀釋度分別接種6只小鼠，連續觀察14d，記錄發病死亡情況，并對死亡小鼠進行檢剖，觀察大體病變，從內臟中分離菌。

1.5 免疫保護試驗 滅活苗制備：將4株臨床分離株在TSB培養基中擴大培養后，進行計數，并加入0.2%甲醛于37℃滅活24h，滅活完成后進行無菌檢驗，離心濃縮菌液至1010CFU／mL制成水相，與白油佐劑（油相，產自美孚公司）1∶1.5充分混合、乳化，制成滅活苗。

免疫方案：取80只小鼠，分為4組，每組20只。各組其中10只小鼠免疫滅活苗，10只小鼠不免疫作為對照。頸背部皮下免疫，一免后2周進行二免，二免后2周用相應分離株致死劑量攻毒。免疫后每周對小鼠進行采血，ELISA測定血清IgG抗體效價。記錄攻毒后小鼠死亡情況，連續觀察14d，計算小鼠免疫后攻毒的死亡率。

用包被液稀釋全菌蛋白，加入96孔酶標板中，4℃過夜。次日進行洗滌、封閉、再洗滌，加入待檢血清，第一孔1∶400倍稀釋，依次進行2倍梯度倍比稀釋至1∶51 200倍，反應1h后洗滌，加入1∶10 000倍稀釋羊抗鼠IgG－HRP反應1h，洗滌、顯色，用酶標儀測OD630值。用陰性待測樣品作為對照，試驗孔測定的OD值為對照OD值的兩倍時，該孔的稀釋倍數就是待測樣品的血清抗體效價值。

1.6 交叉保護試驗 取200只小鼠，分為5組，每組40只小鼠。1～4組分別免疫4種滅活苗，第5組為對照組，每組再分成4小組，每小組10只小鼠。對各小組進行不同分離株攻毒。頸背部皮下免疫，一免后2周進行二免，二免后2周進行相應分離株致死劑量攻毒。統計小鼠免疫后攻毒的死亡率。

2 結果

2.1 細菌培養鑒定 分離株在TSA固體培養基上生長為光滑濕潤、具有藍色熒光、直徑1～2mm的圓形菌落；在綿羊全血TSA固體培養基上，生長為圓形、光滑濕潤的菌落，不發生溶血。均為革蘭陰性短小桿菌，瑞氏染色兩極濃染。生化指標與Pm標準株結果基本一致（表2）。

繪制4株Pm分離株與A型Pm參考株的生長曲線，結果顯示5株Pm生長趨勢相似。1∶100轉接至含4%血清的TSB培養基中，迅速進入對數生長期，在培養6h時達到峰值，6h～15h為穩定期，15 h以后處于衰退期，18h后活菌量迅速下降（圖1）。

2.2 PCR鑒定及分型 以4株分離株與A～F型Pm參考株菌液為模板，用Pm種特異性引物和A型～F型Pm特異性引物進行多重PCR擴增，參考株產物分別為460bp和相應特異性基因大小的片段，4株分離株則擴增出460bp和1 048bp大小的片段（圖2），測序鑒定正確，因此確定這些分離株均為A型Pm。

表2 參考株和分離株的生化鑒定項目

圖1 不同菌株生長曲線

2.3 毒力比較 將4株Pm分別對小鼠進行腹腔攻毒，觀察14d，記錄小鼠死亡情況，結果Pm－HG、Pm－HH和Pm－ZX接種10個菌，即可將小鼠致死。Pm－ZMD則需接種100個菌，才能將小鼠致死。從死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦中均可分離出Pm。根據各梯度小鼠死亡率用改良寇氏法估算LD50，結果Pm－HG、Pm－HH，Pm－ZX和Pm－ZMD的LD50估計值分別為2.2CFU，2.7CFU，2CFU和63CFU。

2.4 免疫原性比較 將4株Pm制成滅活苗，每只小鼠免疫0.2mL，免疫劑量為109CFU／0.2mL。首免2周后進行二免，每周對小鼠進行采血，測定血清IgG抗體效價，Pm－HG和Pm－ZMD制備的滅活苗免疫小鼠，血清抗體效價上升相對較快。二免后兩周，4株菌誘導的血清抗體效價均在1∶20 000以上，其中ZMD株最高，其次為HG株，最低為HH株。Pm－HG組在一免后兩周和二免后一周的血清抗體效價與Pm－ZX和Pm－HH組統計學差異極顯著（P＜0.01）；Pm－ZMD組在二免后兩周的血清抗體效價與其余三組統計學差異顯著（P＜0.05）（圖3）。

二免2周后對小鼠進行攻毒，觀察14d，根據小鼠存活率統計不同分離株滅活苗給小鼠提供的免疫保護率。結果除Pm－HH外，其余3株制備的滅活苗均能100%保護小鼠抵御本菌的攻擊。各菌株對照組未免疫滅活苗，攻毒后死亡率均接近100%（表3） 。

圖3 免疫后小鼠血清抗體效價

表3 小鼠免疫保護試驗

2.5 交叉保護力比較 Pm－HG滅活苗的交叉保護率最高，除能對本菌的攻擊完全保護外，對其他3株菌的交叉保護率都在90%以上（表4）。

表4 滅活菌免疫小鼠對異種菌攻擊的免疫保護

3 討論

近些年，隨著我國養牛業的快速發展，各個地區之間牛只運輸頻繁，導致了運輸應激相關傳染病的增多。牛A型Pm常在應激狀態下，引起牛呼吸系統疾病（bovine respiratory disease，BRD），是牛“船運熱肺炎”病變肺中最常分離出的細菌，單純感染較少見，常與溶血曼氏桿菌、牛支原體和呼吸道病毒等混合感染［7］。目前，臨床上使用的商業疫苗，制苗菌株多為B型Pm，僅用于預防牛出血性敗血癥。由于Pm不同血清型間的交叉保護較差［9］，因此，研制牛A型Pm疫苗迫在眉睫。

有研究表明，小鼠對多殺性巴氏桿菌非常敏感，幾個菌即可將其致死［9］，因此，本試驗選擇小鼠作為動物模型，對比不同Pm臨床分離株的毒力，將4株Pm分別對小鼠進行腹腔攻毒，其中Pm－HG、Pm－HH和Pm－ZX接種10個菌即可將小鼠致死，而Pm－ZMD則需接種100個菌才能將小鼠致死，。表明Pm－HG、Pm－HH和Pm－ZX的毒力很強，且差異不顯著。由于Pm－HG、Pm－HH和Pm－ZX接種劑量小于10個菌時，小鼠死亡率都大于0%，不能滿足計算LD50的公式要求，因此Pm－HG、Pm－HH 和Pm－ZX的攻毒劑量10×LD50估算為22CFU，27CFU和20CFU，而Pm－ZMD的LD50則約為630CFU。

4株Pm制備的滅活疫苗的免疫保護率，除Pm－HH外，其余3株制備的滅活苗均能100%保護小鼠抵御本菌的攻擊。而各菌株對照組未免疫滅活苗，攻毒后死亡率均接近100%。表明用白油佐劑制備的滅活疫苗效果良好，能夠使小鼠抵御10×LD50劑量的攻毒。比較4株Pm制備的滅活疫苗的交叉保護率時，發現Pm－HG滅活苗的交叉保護率最高，除能對本菌的攻擊完全保護外，對其他3株菌的攻擊，交叉保護率都在90%以上。

綜合考慮以上各項指標，本試驗以小鼠為動物模型，確定Pm－HG毒力最強，免疫反應良好，交叉保護率最高，該菌株將是制備A型Pm滅活疫苗的備選菌株。

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