二種牛型提純結核菌素變態反應試驗結果比較

衛龍興，王國賢，盛岳山，戴連群* ，洪云超，韓岳榮

(1.上海市奉賢區動物疫病預防控制中心，上海201400;2.上海市奉賢區莊行鎮畜牧獸醫站，上海201415;3.上海市奉賢區奉城鎮畜牧獸醫站，上海201411)

結核病曾經是人類歷史上最猖獗的傳染病之一，它是一種由結核分枝桿菌引起的、人和多種動物共患的、古老而復雜的慢性傳染病。抗結核藥物的出現，才使這一疾病有所緩解，但由于結核病的生理特性和復雜的社會因素，加之近年來各國對結核病的忽視，使結核病重新成為了全球性的的人類健康問題，全球每年因結核病死亡的人數達200余萬人，而發病數更是超過了800萬人[1-2]，成為了世界范圍內的頭號殺手。我國是結核病嚴重流行的國家，其發病率和死亡率均僅次于印度而居世界第二位，結核病也因此成為了我國重點防控的傳染病之一。結核病牛是人類結核病的主要傳染源，但對于結核病牛的檢測方法，目前世界上普遍采用世界動物衛生組織(OIE)推薦的提純結核菌素(PPD)皮內變態反應試驗(簡稱PPD試驗)[3]，我國也不例外。但采用這一方法檢測結核病牛易受到PPD非特異性反應的干擾而造成誤判。為了解和分析國內外不同廠家生產的牛型PPD的反應性，試驗選擇了國產和荷蘭產二種牛型PPD，對轄區內兩家不同規模奶牛場的100頭青年奶牛進行了一次皮內變態反應試驗的結果比較。

1 材料與方法

1.1 參試牛只 隨機選取某存欄奶牛2000頭以上大型奶牛場12～18月齡青年母牛85頭和某存欄奶牛200頭左右小型奶牛場12～18月齡青年母牛15頭，共100頭青年母牛。

1.2 參試PPD 國產牛型提純結核菌素(簡稱國產PPD)，哈藥集團生物疫苗有限公司，批號:201003，使用前用滅菌注射用水稀釋成每mL含PPD 20000 IU。荷蘭產牛型提純結核菌素(簡稱荷蘭產PPD)，荷蘭Prionics公司，批號:102115，每mL含PPD 30000 IU。

1.3 方法

1.3.1 牛只處理 對所有參試牛只按照(《動物結核病診斷技術》GB/T18645-2002)PPD皮內變態反應試驗的要求，在每頭牛左右兩側的頸中部上三分之一處進行剪毛(面積大于10 cm×10 cm)、量取原皮厚、作好記錄、局部消毒。采用英國進口全金屬自動進量連續皮內注射器，分別在每頭參試牛的左側頸部剪毛消毒處皮內注射國產PPD 0.1 mL(2000 IU)、在右側頸部剪毛消毒處皮內注射荷蘭產PPD 0.1 mL(3000 IU)，并確認注射有效。

1.3.2 試驗判定 72 h后觀察反應，測量每個試驗點的皮厚，每頭牛對應作好記錄，并計算與原皮的皮厚差。國產和荷蘭產二種牛型PPD均按照(《動物結核病診斷技術》GB/T18645-2002)牛型結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗的標準進行判定[3]。

陽性反應:局部有明顯的炎性反應，皮厚差大于或等于4.0 mm者，判為陽性反應，記作(+)。疑似反應:局部炎性反應不明顯，皮厚差大于或等于2.0 mm、小于4.0 mm者，判為可疑，記作(±)。陰性反應:無炎性反應，皮厚差在2.0 mm以下者，判為陰性，記作(-)。

1.3.3 細菌培養復核試驗 對PPD試驗判定結果為陽性的牛只，撲殺后采取肺門淋巴結樣品送上海市疾病預防控制中心作結核桿菌細菌培養和分離鑒定[3]。

2 結果與分析

2.1 二種PPD試驗結果(反應點)比較 二種牛型PPD各進行了100個皮內變態反應試驗點，結果國產PPD有30個試驗點、荷蘭產PPD有20個試驗點分別出現不同程度的變態反應。經綜合判定后，共有10個試驗點被判為(+)、40個試驗點被判為(±)。綜合判定結果見表1。

表1 國產和荷蘭產PPD試驗結果(反應點)比較 單位:頭

分析表1發現:在皮內注射劑量荷蘭產PPD＞國產PPD的情況下，10個(+)和40個(±)反應試驗點，國產PPD與荷蘭產PPD的(+)反應比例為7∶3，(±)反應比例為23∶17;從出現反應的試驗點數量分析，國產PPD的皮內變態反應試驗結果明顯大于荷蘭產PPD。

2.2 相同判定結果牛只不同PPD皮內變態反應結果的比較 對30個國產PPD和20個荷蘭產PPD出現變態反應試驗點的牛只，依據二種PPD的皮內變態反應判定結果進行比較(表2)。

表2 國產與荷蘭產PPD判定結果(牛只)比較 單位:頭

分析表2發現，二種PPD的50個反應點集中在36頭試驗牛，其中有9頭牛國產PPD和荷蘭產PPD的判定結果相符[2頭(+)、7頭(±)]，占出現反應牛只總數的25%。有20頭牛國產PPD的判定結果＞荷蘭產PPD，占出現反應牛只總數的55.6%;其中5頭國產PPD判定結果為(+)的牛只，荷蘭產PPD判定結果為4頭(±)和1頭(-);15頭國產PPD判定結果為(±)的牛只，荷蘭產PPD判定結果均為(-)。另有7頭牛國產PPD的判定結果＜荷蘭產PPD，占出現反應牛只總數的19.4%;其中1頭國產PPD判定結果為(±)的牛只，荷蘭產PPD判定結果為(+);6頭國產PPD判定結果為(-)的牛只，荷蘭產PPD判定結果為(±)。

結果顯示:36頭出現變態反應的試驗牛中，除9頭牛(25%)二種PPD的判定結果相符外，其余27頭牛(75%)二種PPD的判定結果出現了不同程度的分離，而且國產PPD判定結果＞荷蘭產PPD的牛只數顯著大于荷蘭產PPD判定結果＞國產PPD 的牛只數(20∶7)。

表3 二種PPD試驗結果分離的牛只分類比較單位:頭

對27頭國產和荷蘭產二種PPD試驗結果出現分離牛只判定結果的分類比較見表3。結果顯示:在國產PPD試驗結果＞荷蘭產PPD的5頭(+)和15頭(±)牛中，荷蘭產PPD僅4頭牛表現(±)，其余16頭牛均為(-);而在荷蘭產PPD試驗結果＞國產 PPD的1頭(+)和6頭(±)牛中，國產PPD只有1頭牛的試驗結果為(±)，其他均為(-)。

綜合表2和表3的比較結果，在國產PPD的使用劑量(2000 IU)小于荷蘭產PPD(3000 IU)的情況下，國產PPD的皮內變態反應試驗結果(牛頭數)顯著大于荷蘭產PPD。

經采用統計學分析T檢驗的方法計算，國產和荷蘭產二種PPD變態反應成對試驗皮厚差之間的P值為0.00298，二種PPD試驗結果差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 復核試驗結果 采用結核桿菌細菌培養的方法對PPD皮內變態反應試驗判定結果(+)牛只進行復核。經對8頭PPD試驗(+)牛只[2頭二種PPD均為(+)、5頭國產 PPD(+)、1頭荷蘭產PPD(+)]肺門淋巴結樣品進行結核桿菌培養，結果全部為陰性[4-5]。結果提示PPD試驗(+)結果可能為非特異性反應。

3 討論與小結

由于試劑采購及試驗方案設計等因素影響，試驗過程未能采用PPD國際標準品或國家標準品與二種參試PPD的判定結果進行比較，但通過對二種參試PPD相關試驗結果的系統分析與比較，結果顯示國產PPD反應性顯著大于荷蘭產PPD，可能影響牛結核病檢疫結果的判定，應在臨床應用中注意復核。

PPD試驗陽性樣品結核桿菌細菌培養復核結果顯示，二種PPD診斷液均存在較強的非特異性反應，而且雖然國產PPD診斷液的使用劑量較小，但反應結果卻顯著大于荷蘭產PPD診斷液。綜合試驗結果證明:國產PPD診斷液的非特異性反應較強，應注重多種檢測方法的綜合判定。

[1]郭開彬.奶牛結核病流行病學調查研究[J].草業與畜牧.2008，12:39-43.

[2]全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.第四次全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中華結核和呼吸雜志，2002，25(1):3-7.

[3]毛開榮，陳向經，關孚時.動物結核病診斷技術(GB/T 18645-2002)[S].

[4]世界動物衛生組織.哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊[M].北京:中國農業出版社，2002:337-349.

[5]何昭陽，胡希榮，王振國.結核變態反應陽性牛的非典型性分枝桿菌的分離和鑒定[J].畜牧獸醫學報 ，1994，25(3):247-251.