正交試驗法優選宮衣凈酊滲漉提取工藝研究

崔東安，王學智，王旭榮，張景艷，王磊，秦哲，李建喜，楊志強

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州730050;農業部新獸藥工程重點實驗室，蘭州730050;甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州730050)

宮衣凈酊主要由益母草、紅花、葛根和車前子等中藥組成，用于奶牛胎衣不下的防治，可有效促進滯留胎衣排出，改善奶牛產后繁殖性能[1]。目前該制劑屬臨床中試產品，其工藝繁雜、生產周期長、有效成分轉移率低。合理的提取工藝是中藥生產的一個重要操作單元，直接關系到中藥制劑的質量和臨床應用效果[2-3]。目前，中藥生產常用的提取工藝評價指標是以中藥提取浸出物的收得率和某一確切成分的浸提收得率或含量為指標[4]。紅花是宮衣凈酊主藥之一，其主要生物活性成分是以羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA)為代表的查耳酮類化合物[5]。本研究旨在探討乙醇體積分數、溶媒用量、滲漉速度和浸漬時間等因素對滲漉提取工藝的影響，采用 L9(34)正交設計方法，以HSYA含量和浸膏得率為指標對宮衣凈酊的滲漉提取工藝進行優選。

1 材料

1.1 儀器 戴安U-3000高效液相色譜儀，美國戴安公司;Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷倫科技公司;超聲波清洗器KQ-250型，昆山市超聲儀有限公司;SNW ultra-pure water system:力康公司;旋轉蒸發儀EYELAN-1100;ME235S微量分析天平。

1.2 藥品 HSYA(批號:111637-201106，含量92.5%)，中國藥品生物制品檢定所。益母草、紅花、葛根和車前子等藥材，甘肅蘭州黃河藥材市場。甲醇、磷酸、三乙胺和乙醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 試驗設計 建立宮衣凈酊中HSYA高效液相色譜測定方法，以HSYA含量和滲漉浸膏得率為考察指標，采用L9(34)正交實驗法，選擇乙醇體積分數、溶媒用量、滲漉速度和浸漬時間為考察因素，優選宮衣凈酊滲漉提取工藝。

2.2 宮衣凈酊中HSYA的含量測定方法研究

2.2.1 樣品制備

2.2.1.1 宮衣凈酊樣品溶液制備:按比例稱取處方下各藥材粗粉(粉碎各藥材并過二號篩)，按照正交設計表1進行滲漉提取，收取滲漉液，40℃減壓濃縮回收乙醇，流浸膏用50%乙醇稀釋至1 mL藥液含0.5 g原生藥材，即為正交提取樣品，標記備用。

2.2.1.2 供試品溶液制備:精密量取宮衣凈酊樣品溶液10 mL，蒸干，殘渣用25%甲醇溶解，置于10 mL量瓶中，25%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.1.3 對照品溶液制備:精密稱取HSYA對照品，加25%甲醇制得每1 mL溶液中含2.26 mg HSYA的對照品貯備液，4℃冷藏備用

2.2.1.4 陰性樣品溶液制備:另取不含紅花藥材的陰性樣品溶液，按照供試品溶液制備方法制備成陰性樣品溶液。

2.2.2 色譜條件及系統適應性試驗 ZORBAX E-clipse Plus C18色譜柱;甲醇-0.5%磷酸(三乙胺調pH至4.0)(25:75)為流動相;檢測波長為403 nm;流速為0.8 mL/min;進樣量5 μL;柱溫25℃。在上述色譜條件下，供試溶液中HSYA色譜峰達到基線分離，峰形對稱度高，且陰性無干擾，見圖1-圖3。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 線性關系考察:精密量取HSYA標準貯備 液，制 備 成 0.02825、0.05650、0.11300、0.226000、0.452000和0.904000 mg/mL的濃度梯度對照品溶液。按照2.2項下色譜條件，取上述對照品溶液進行HPLC分析，以對照品溶液濃度y相對應的峰面積x進行線性回歸分析，得標準曲線方程y=0.4798x-2.156，相關系數為R2=0.9997，結果表明，HSYA峰面積與濃度在0.14～4.52 μg范圍內呈良好線性關系。

2.2.3.2 重復性試驗:取同一批次宮衣凈酊樣品，按照供試品溶液制備方法同時制備6份，測定HSYA含量。結果，HSYA含量為分別為0.463、0.469、0.460、0.458、0.456、0.473、0.468 mg/mL，RSD為1.36%，表明該方法可行，重復性好。

2.2.3.3 精密度試驗:取同一供試品溶液，重復進樣6次，按照2.2項下色譜條件，測定其峰面積，計算RSD。結果HSYA的峰面積分別為213.5120、213.7471、214.1611、214.9575、217.4039、210.5957，RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.4 穩定性試驗:取新制備的供試品溶液，于0、2、4、8、12和24 h進樣1 次，記錄 HSYA 峰面積。結果，HSYA峰面積分別為的RSD為1.08%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.3.5 加樣回收率試驗:精密量取同一批次已知含量的宮衣凈酊溶液6份，每份5 mL，置10 mL量瓶中，分別加入與樣品所含HSYA量相當對照品，加稀乙醇溶液至刻度，搖勻。按2.1項下方法制備供試品溶液，進行含量測定，計算加樣回收率。結果見表1，平均回收率為96.89%，RSD為173%，表明本試驗具有良好的回收率。

回收率=(實測值-供試品中HSYA含量)/對照品HSYA加入量×100%。

表1 加樣回收率試驗結果

2.3 浸膏得率測定 按照《中華人民共和國獸藥典》二〇一〇年版二部附錄浸出物測定法，精密量取各樣品溶液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105℃ 干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定其重量，以干燥浸膏得率計算供試樣品中浸出物的含量。按下列公式計算浸膏得率，浸膏得率(%)=浸膏質量/20 mL藥液相當于藥材質量×100%。

2.4 正交試驗結果 選用 L9(34)正交表，以HSYA含量為標示性成分和浸膏得率為評價指標，對乙醇體積分數(A)、溶媒用量(B)、滲漉速度(C)和浸漬時間(D)四個因素進行正交試驗，每個因素設3個水平考察處方提取工藝，因素水平見表2。按照2.2.1項下方法制備正交提取樣品，分別測定HSYA含量和浸膏得率，結果見表3和表4。HSYA含量為衡量滲漉提取工藝的主要指標，設定權重系數為0.7。浸膏得率在實際生產中具有重要意義，將浸膏得率作為次要指標，設定權重系數為0.3[6]。綜合評分=70×(HSYA含量/HSYA含量max)+30×(浸膏得率/浸膏得率max)

表2 試驗因素水平設計

從表3中R值的大小顯示，各因素作用的主次為:乙醇體積分數、滲漉速度、浸漬時間和溶媒用量。方差分析結果表明，乙醇體積分數對滲漉提取影響較大，差異顯著(P＜0.05)。以A2B3C2D2組合為優選工藝，即加入12倍量70%乙醇，浸漬24 h，以2 mL/(min·kg)進行滲漉提取。由方差分析結果知，溶媒用量對滲漉提取效果的影響不顯著(P＞0.05)，考慮生產成本，確立優選提取工藝為A2B2C2D2，即加入10倍量70%乙醇，浸漬24 h，以2 mL/(min·kg)進行滲漉提取。

表3 正交試驗結果

表4 正交試驗綜合評分方差分析結果

2.5 工藝驗證試驗 考察上述優選提取工藝的可靠性，按照上述優選滲漉提取工藝條件，進行了3次驗證試驗，HSYA含量分別為 0.472、0.499和0.463 mg/mL，RSD為 1.77%;浸膏得率分別為16.87%、17.26%和16.61%，RSD為1.93%。結果表明，優選工藝穩定、可行。

3 討論

藥典中測定紅花HSYA含量采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)為流動相，該色譜條件下色譜峰易產生拖尾現象[7]。宮衣凈酊為中藥復方制劑，成分較為復雜，對HSYA含量測定干擾大。參考相關文獻[8-10]，本試驗以甲醇-磷酸溶液為溶劑系統，經過多次色譜條件優化試驗研究，當以甲醇-0.5%磷酸溶液(25∶75)為流動相時，HSYA色譜峰達到基線分離，峰形對稱度高，系統適應性試驗符合要求，適用于宮衣凈酊中HSYA的定量分析。該方法的建立為進行宮衣凈酊制備工藝優化和質量標準研究提供了定量分析方法。

HSYA屬查耳酮類化合物，遇熱不穩定[11]，而滲漉提取屬動態浸出方法，溶劑利用率高，有效成分浸出完全，適于熱不穩定成分提取分離[2]，故本研究在保持產品原有酊劑劑型的基礎上，采用了滲漉提取工藝。綜合考察乙醇體積分數、溶媒用量、滲漉速度和浸漬時間四個因素對提取效果的影響，本研究優選獲得了宮衣凈酊的滲漉提取條件，即加入10倍量70%乙醇，浸漬24 h，以2 mL/(min·kg)進行滲漉提取。工藝驗證試驗結果表明該工藝穩定、可行、節約成本、有效成分浸出率高。

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