恩諾沙星注射液中非法添加磺胺嘧啶HPLC-PDA檢查法的建立

郭桂芳，楊 星，董玲玲，徐 嫄，郝利華

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

目前政府對獸藥市場制假、造假打擊力度日漸加深，而非法添加現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生。筆者在對某企業(yè)某批次恩諾沙星注射液進(jìn)行監(jiān)督抽檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，除主成分外還發(fā)現(xiàn)處方外成分。隨即對該未知成分用HPLC-PDA法對其色譜行為和光譜行為進(jìn)行進(jìn)一步研究探討，通過與對照品保留時(shí)間及光譜圖的匹配度的比對，確證其中未知物為磺胺嘧啶，為處方外非法添加物，對此建立相應(yīng)的檢查方法[1-3]。本方法的建立為監(jiān)管部門執(zhí)法提供了技術(shù)依據(jù)，并為非法添加檢查方法的建立提供參考和借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 高效液相色譜儀Waters 2695，二極管陣列檢測器2998(PDA)，美國waters公司;精密天平AE240，精度0.01 mg，梅特勒精密儀器廠。

1.2 受試藥物 磺胺嘧啶對照品、磺胺對甲氧嘧啶對照品、磺胺間甲氧嘧啶對照品、磺胺喹噁啉對照品、磺胺氯達(dá)嗪鈉對照品，均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。恩諾沙星注射液:某市售產(chǎn)品，規(guī)格10 mL:0.5 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別檢查 采用《中華人民共和國獸藥典》2010年版一部[4]恩諾沙星注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鑒別(2)方法，色譜條件為:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，0.025 mol/L磷酸溶液(以三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0)，檢測波長278 nm。

結(jié)果見圖1、圖2。受試樣品色譜圖中檢出兩色譜峰，10.7min處與對照品色譜峰一致，為主成分恩諾沙星，4.763 min處峰為未知峰。

圖1 受試樣品色譜圖

圖2 恩諾沙星對照品色譜圖

2.2 HPLC-PDA篩查

2.2.1 HPLC-PDA色譜結(jié)果 將2.1項(xiàng)中將紫外檢測器改為PDA檢測器。對受試樣品按2.1項(xiàng)條件測定。結(jié)果見圖3。色譜圖中9.124 min處為恩諾沙星峰，其最大吸收波長為278 nm，7.111 min處為未知峰，最大吸收波長為267 nm。對未知峰進(jìn)行峰純度分析，見圖4，純度小于閾值。故未知峰為單一成分。其最大吸收波長與光譜圖特征與磺胺類藥物類似。

2.2.2 對照品對比試驗(yàn) 分別取各磺胺對照品適量，加0.1 mol/L氫氧化鈉試液10 mL使溶解，加流動相稀釋至約0.1 mg/mL，按上述色譜條件，測定受試樣品中未知峰與各對照品色譜圖主峰保留時(shí)間是否一致，光譜圖是否匹配。結(jié)果見圖5、圖6。磺胺嘧啶對照品主峰保留時(shí)間與供試樣品未知峰保留時(shí)間一致;兩色譜峰最大吸收波長及光譜指數(shù)圖相匹配。

2.3 方法學(xué)考察及優(yōu)化

2.3.1 耐用性 流動相比例改變:色譜柱采用Alltima C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)，在藥典[4]規(guī)定范圍調(diào)節(jié)流動相比例。色譜分離表明，水相與有機(jī)相之比為78∶22時(shí)，兩峰分離度小于1.5，當(dāng)比例為88∶12時(shí)，恩諾沙星峰保留時(shí)間超過30 min，故選擇流動相比例為83∶17。不同型號色譜柱的影響:采用不同型號C18柱，其他條件不變時(shí)，測定結(jié)果見表1。

圖3 供試樣品光譜圖與色譜圖

圖4 未知峰純度圖

圖5 磺胺嘧啶對照品和受試樣品色譜圖

圖6 磺胺嘧啶對照品和供試樣品7．1 min色譜峰匹配圖

表1 不同型號色譜柱對方法系統(tǒng)適用性的影響

上述三種型號色譜柱均能使恩諾沙星峰與磺胺嘧啶峰分開。

2.3.2 線性 取磺胺嘧啶對照品50 mg，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液使溶解，加流動相稀釋至刻度搖勻，精密量取 1、3、5、7、9 mL 于50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，測定。按磺胺嘧啶峰面積與對應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

磺胺嘧啶回歸方程為y=873577x+98154，R2=1。表明磺胺嘧啶在20～180 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 檢測限與定量限 恩諾沙星儲備液:取恩諾沙星對照品25 mg，用流動相稀釋制成每1 mL含0.5 mg/mL的溶液，備用。

檢測限溶液制備:取磺胺嘧啶對照品適量，加恩諾沙星儲備液1 mL于10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，測定。光譜指數(shù)圖失真前的濃度為本法的檢測限，S/N≥10的濃度為定量限。該色譜條件下磺胺嘧啶檢測限為 5 μg/mL，定量限為10 μg/mL。

2.3.4 準(zhǔn)確度 以磺胺嘧啶鈉注射液10 mL:1 g規(guī)格為100%，分別以80%、100%、120%進(jìn)行三個(gè)濃度各三平行添加回收，其中含恩諾沙星的量不變。回收率結(jié)果見表2。

表2 磺胺嘧啶回收率結(jié)果

2.4 樣品測定結(jié)果 用上述建立的HPLC-PDA法對該批恩諾沙星注射液進(jìn)行了磺胺嘧啶的含量測定，六份平行樣測定結(jié)果見表3。

表3 恩諾沙星注射液中磺胺嘧啶含量測定結(jié)果(mg/mL)

3 討論

目前對于獸藥非法添加仍然采取檢出何種添加物建立該成分的檢測方法，并以補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)予以發(fā)布，結(jié)果可能會出現(xiàn)該成分在不同產(chǎn)品中添加而建立一系列的補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行一系列的方法學(xué)研究資料，造成大量重復(fù)性工作。筆者認(rèn)為建立一個(gè)比較完整的常見獸藥數(shù)據(jù)庫顯得更加尤為重要，發(fā)現(xiàn)問題產(chǎn)品時(shí)，通過直接與數(shù)據(jù)庫比對其光譜行為和色譜行為，來判斷處方外成分，即可大大縮短方法建立時(shí)間，可快速為獸藥監(jiān)管部門執(zhí)法提供有力的技術(shù)保障。而本文中所進(jìn)行的定性、定量研究手段可作為數(shù)據(jù)庫建立時(shí)方法建立的借鑒。

[1]郝利華，于曉輝，董玲玲，等.HPLC-PDA法同時(shí)測定黃芪多糖注射液中非法添加的四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物[J].中國獸藥雜志，2012，46(8)，28-31.

[2]郝利華，畢言鋒，郭桂芳，等.HPLC-PDA法測定黃芪多糖注射液中非法添加利巴韋林的試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49(2)，76-78.

[3]吳小紅，李煥德.高效液相色譜法-二極管陣列檢測器同時(shí)分析測定中成藥及保健品中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素[J].中南藥學(xué)，2009，7(5):324-327.

[4]中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國藥典二○一○年版一部[S].