HPLC法測定沙棘葉、果實、枝條中齊墩果酸和熊果酸的含量

滕曉萍，王宏昊，花圣卓，劉 洋，關 銘

（1.高原圣果沙棘制品有限公司，北京 100036；2.吉林大學藥學院，長春 130021）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL·）是胡頹子科（E1aeagnaceae）沙棘屬的灌木或小喬木。別名醋柳、黑刺、酸刺、沙棗、其察日嘎納（蒙名）、達普（藏名）、吉汗（維吾爾名）。沙棘是蒙古族和藏族常用中藥材，具有較高的藥用價值。依據中醫學理論，沙棘具有利肺、升陽、健脾、養胃、活血化瘀、消炎生肌等藥理功效［1］。沙棘中含有齊墩果酸和熊果酸成分。齊墩果酸具有護肝降酶、降低血脂、抗炎利尿、抗腫瘤等作用［2］。熊果酸具有顯著的抗致癌、抗促癌和免疫作用［3］，具有降低血脂、防止動脈粥樣硬化及由其引起的心腦血管病作用［4］。

目前，使用HPLC法同時測定中藥中齊墩果酸和熊果酸含量的報道較多［5-15］，但對沙棘葉及枝條中齊墩果酸和熊果酸的含量測定至今尚未見文獻報道。為開發沙棘葉新的藥用資源，本研究建立了同時測定沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC法，為分析、評價沙棘及其相關制品以及有關質量控制，提供參考依據。

1 儀器與試藥

LC-20ATVP高效液相色譜儀及LC-solution工作站（日本島津公司）；AB-E 分析天平（METTLER TOLEDO）；紫外掃描儀（日本島津UVmini-1240）；超聲清洗器（KQ 3200DE 昆山市超聲儀器有限公司）。

齊墩果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所批號：110709-200505）；熊果酸對照品（四川維克奇生物科技有限公司）；甲醇（色譜純 天津市四友生物醫學技術有限公司）；娃哈哈純凈水；乙醇（分析純 北京化工廠）。

2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack型C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（87∶13）；檢測波長210nm；柱溫30℃；流速1.0mL/min；進樣量：10μL。對照品及樣品分析的HPLC 圖譜見圖1、圖2、圖3。

3 溶液制備

3.1 對照品溶液的配制

精密稱取齊墩果酸對照品1.4mg，熊果酸對照品1.5mg，分別置于10mL 容量瓶中。加入乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。齊墩果酸和熊果酸對照品溶液濃度均分別為0.14mg/mL 和0.15mg/mL。

3.2 供試品溶液的配制

稱取沙棘葉25.0g，適當粉碎。以300mL95%乙醇回流提取2 次，第1 次回流2.0h，第2 次回流1.5h，回流溫度為95℃。提取液經濃縮、烘干、真空干燥后得沙棘葉提取物粉末。精密稱取上述沙棘葉提取物粉末44.8mg，置于10.0mL 容量瓶，加8.0mL 乙醇，超聲提取20min，加入乙醇定溶至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，用0.45μm 微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

4 結果

4.1 線性關系考察

取上述對照品溶液，分別以5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL進樣分析。以峰面積對進樣量進行線性回歸，齊墩果酸和熊果酸的回歸方程分別為：Y=410182x+13635，r=0.9994；Y=400000X+17667，r=0.9993，結果表明齊墩果酸和熊果酸在0.7～2.1μg和0.75～2.25μg范圍內呈良好的線性關系。

4.2 精密度實驗

精密吸取對照品溶液10μL，重復進樣5次，分別測定峰面積值，計算出齊墩果酸RSD%為1.33%，熊果酸的RSD%為2.63%。表明方法精密度良好。

4.3 重復性實驗

精密稱取沙棘葉提取物粉末6 份，按“3”項下方法制備溶液并進樣測定。根據峰面積值，計算齊墩果酸的RSD%為2.39%，熊果酸的RSD%為1.54%，方法重現性良好。

4.4 穩定性試驗

取樣品按“3”項下方法制成供試品溶液，按照“2”項下色譜條件在0h、2h、4h、8h、12h 測定，用外標法計算其含量。結果為供試品溶液中齊墩果酸和熊果酸的RSD%分別為1.33%和2.63%，表明供試品溶液在12h內性質穩定，可滿足測定需要。

4.5 加樣回收率實驗

準確稱取已知齊墩果酸和熊果酸含量的沙棘葉提取物粉末6份，分別加入齊墩果酸和熊果酸對照品混合溶液適量，配制加標樣品溶液。進樣測定齊墩果酸和熊果酸的含量，計算回收率。齊墩果酸和熊果酸的平均加樣回收率分別為99.88%（RSD=2.95%）和100.80%（RSD=2.81%）。

4.6 含量測定

取沙棘葉適量，按供試品制備方法處理，按照上述HPLC條件測定，采用外標法測定沙棘葉中齊墩果酸含量為0.081%，熊果酸含量為0.221%，即三萜酸總含量為0.302%。

為全面考察三萜酸在沙棘各部位的分布情況，使用上述條件和方法，也測定沙棘枝條和沙棘果實中三萜酸成分含量，結果見下表1。

表1 三萜酸在沙棘中的含量分布

5 討論

（1）沙棘是一種藥食同源植物，在我國分布廣泛，資源豐富，其應用前景可觀。但沙棘葉的利用率較低，截至目前為止，尚未見有關沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量測定的報道。本研究首次建立了同時測定沙棘葉中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC方法。結果表明，該方法具有良好的準確度、精密度和重現性。

（2）HPLC 法測定齊墩果酸和熊果酸的含量，采用紫外檢測器時，需要選擇適宜的檢測波長。由于二者的最大吸收波長均在202nm左右，若檢測波長小，溶劑系統（甲醇-水）的截止波長（205nm）接近檢測波長，則造成基線噪音大，基線平衡困難；若檢測波長大，則二者的吸收值太低，響應因子小，靈敏度降低，同樣影響組分的檢測。因此，本研究結果證明，采用HPLC法測定齊墩果酸和熊果酸含量時，以選擇210nm作為檢測波長較適宜。

（3）齊墩果酸和熊果酸互為三萜類同分異構體，結構十分相似，分離困難較大。經比較甲醇-水、甲醇-磷酸、甲醇-冰醋酸和乙腈-水體系后，選擇甲醇-0.2%磷酸體系作為流動相，分離效果較好。

采用本文建立的方法同時測定沙棘葉中兩者的含量，操作簡便、手段先進、結果準確可靠。

在科研上，目前基本只注重對于沙棘黃酮的研究，已有大量關于沙棘黃酮的先進提取、分離方法的文獻報道，而針對其他活性成分的報道甚少。

目前，沙棘中三萜酸和生物堿類成分的深入研究和開發利用尚屬空白，對沙棘的果實、莖、葉等各部位中三萜酸和生物堿類成分的提取分離、含量測定以及質量標準方面研究尚未見研究報道。本研究是高原圣果沙棘制品有限公司和吉林大學共同的研究課題，著重研究我國資源豐富、易于收集且易于儲存的沙棘葉為研究對象，對其中的三萜酸和生物堿類活性成分的提取工藝和質量標準進行了較為系統的研究，以期為沙棘中三萜酸和生物堿類成分的開發奠定理論基礎，為進一步開發沙棘藥品和沙棘保健品提供參考依據。

[1]周張章,周才瓊.沙棘的化學成分及保健作用研究進展[J].糧食與食品工業,2005，12（2）：15-18.

[2]馬瑜紅.沙棘的有效成分及藥理研究進展[J].四川生理科學雜志,2005,27（2）：75-77.

[2]LIAO Qing-Gui（廖清貴）.Development of oleanolic acid of natural drug（齊墩果酸天然藥物的開發）[J].Sci Technol Forest Sichuan（四川林業科技），1999,20（4）：68.

[3]孟艷秋,陳瑜,王趲,等.熊果酸的研究進展[J].中國新藥雜志,2007,16（1）：25-28.

[4]宋京,張慶林.熊果酸藥理作用研究進展[J].中草藥,1999,30（增刊）：95 -96.

[5]顧學芳,田澍,黃丹.苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的提取及含量測定[J].食品研究與開發,2008,29（5）：96-98.

[6]廖瓊峰,李繼,吳筱妹,等.反相高效液相色譜法測定陸英中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].藥物分析雜志,2005,25（7）：781-783.

[7]白雪梅,付煜榮,田嘉銘.高效液相色譜法測定大山楂丸和山楂鮮果中齊墩果酸及熊果酸的含量[J].中國醫院藥學雜志,2006,26（8）：981-982.

[8]王志芳,汪芳安,彭光華,等.木瓜中齊墩果酸和熊果酸提取工藝的研究[J].食品科技,2006,7：134-137.

[9]黃宏偉.不同花色映山紅花中熊果酸和齊墩果酸的含量比較[J].生命科學儀器,2008,6（12）：17-19.

[10]李坤平,潘天玲,賁永光,等.超聲波強化溶劑提取姜味草中熊果酸和齊墩果酸[J].林產化學與工業,2009,29（3）：111-114.

[11]鄒盛勤,陳武.反相高效液相色譜法測定不同產地紫蘇子和白蘇子中烏索酸和齊墩果酸[J].生物加工過程,2008,6（4）：65-68.

[12]陳世斌,徐社金,江小蓉,等.高效液相色譜法測定枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].Pharmacy Today,2009,19（2）：46-47.

[13]蔡中齊,馬鴻雁,張勉.不同產地及外觀形態夏枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量比較[J].廣東藥學院學報,2009,25（3）：256-258.

[14]相廷英,楊光.常用中藥中齊墩果酸和熊果酸的含量測定[J].中國醫院藥學雜志,2004,24（5）：316-318.

[15]羅曉清,祝瑋,錢蘇生.RP-HPLC法測定石楠葉中熊果酸和齊墩果酸的含量[J].現代中藥研究與實踐,2003,17（5）：14-15.