有氧運動對衰老大鼠骨骼肌細胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響

劉寧寧，李明學，金雯

(江蘇大學1.基礎醫學與醫學技術學院，2.體育部，江蘇 鎮江212013)

骨骼肌是人體重要的運動器官，其機能的下降是衰老的重要標志。骨骼肌衰老時，最大肌力與肌肉最大輸出功率明顯下降，主要與骨骼肌萎縮有關［1］。肌纖維總數不斷下降，從而產生不可逆轉的衰老性肌肉萎縮。從分子水平而言，肌纖維數目的減少是由于細胞凋亡而引起的［2］。增齡過程中，線粒體功能紊亂，導致肌細胞凋亡速度加快，肌纖維數量下降［3］。因此，可采取有效措施來降低骨骼肌細胞的凋亡，從而延緩肌肉衰老的發生發展。本文通過研究有氧運動對衰老模型大鼠骨骼肌細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，來探討有氧運動延緩骨骼肌細胞衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

D-半乳糖(Sigma公司)，Bax單克隆抗體、Bcl-2單克隆抗體(Santa Cruz公司);HRP-羊抗大鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司);增強發光劑試劑盒(Amersham Biosciences公司);TUNEL檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實驗動物

21月齡雌性SD大鼠8只(老年對照組)，體質量(400±10)g;3月齡雌性SD大鼠40只，體質量(200±10)g。所有大鼠均由江蘇大學醫學實驗動物中心提供。分籠飼養，每籠8只，飼以標準嚙齒類動物飼料，不限制飲食，自由飲水，室溫18～23℃，相對濕度41% ～57%，適應性飼養1周后建造模型。

1.3 實驗分組及運動訓練

將40只3月齡雌性SD大鼠隨機分成青年對照組(n=8)和衰老模型組(n=32)，采用D-半乳糖腹部皮下注射法建立衰老模型［4－5］。用生理鹽水將D-半乳糖配置成5%的注射液，衰老模型組大鼠每天注射1次(500 mg/kg)，青年對照組則每天注射相應劑量的生理鹽水，連續注射6周。末次注射后，禁食12 h，分別處死青年對照組8只、老年對照組8只和衰老模型組(隨機選取8只)。

剩余的衰老模型組SD大鼠隨機分為3組，每組8只，分別為衰老模型對照組，3次/周運動組，6次/周運動組。運動采取無負重游泳的方式，水溫為(32±1)℃，水深為60 cm，并確保其不停地游泳。對照組則放入同樣溫度的淺水中。運動組首次游泳時間為30 min，然后以10 min/d遞加，直到90 min，以后保持不變。每次游泳結束后，用吹風機吹干大鼠皮毛，共訓練12周。

1.4 標本收集

造模結束時，分別取青年對照組、老年對照組和衰老模型組大鼠的左心室游離壁全層的心肌組織，用4%低聚甲醛固定24 h，再用蔗糖沉淀過夜。然后制作冰凍切片，厚度為10 μm，每個標本取不連續的2張，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，判斷模型建造情況。運動結束時，分別取衰老模型對照組及2組運動組大鼠的腓腸肌組織，各分成2份，一份同上述操作，用于TUNEL法檢測細胞凋亡情況;另一份則立刻－70℃凍存，用于蛋白質檢測。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡

按照TUNEL法檢測細胞凋亡試劑盒的說明進行操作，然后于顯微鏡下觀察計數。呈藍色的為正常細胞，呈棕黃色的為凋亡細胞。每張切片選取5個高倍視野(×400)，對凋亡陽性細胞進行計數，每只大鼠取2張切片。根據公式:細胞凋亡指數=凋亡陽性細胞數/總細胞數，計算細胞凋亡指數。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白表達

制備蛋白樣品:取凍存的骨骼肌標本100 mg，加細胞裂解液1 mL，PMSF，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑各10 μL，置勻漿器于冰上勻漿30 min。然后，4℃離心，12 000×g，15 min。取上清，測定蛋白含量，再加入等體積的2×上樣緩沖液，混勻后煮沸3 min，－20℃保存備用。蛋白檢測:配制SDS-PAGE;每孔30 μg總蛋白量上樣;電泳;轉膜，一抗為1∶400的鼠抗Bax(Bcl-2)單克隆抗體，二抗為1∶5 000的HRP-羊抗鼠IgG;曝光;用ECL發光劑顯色。

1.7 統計學處理

采用SPSS 13.0統計分析軟件，數據以均數±標準差(±s)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用 LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 衰老模型制備的結果

TUNEL染色結果顯示(圖1)，與青年對照組比較，老年對照組及衰老模型組的凋亡心肌細胞明顯增多，老年對照組的凋亡細胞與衰老模型組比較，差異無統計學意義。老年對照組(33.692±2.766)與衰老模型組(34.146±2.931)的心肌細胞凋亡指數均顯著高于青年對照組(4.132±0.308)，P均＜0.05。衰老模型組的心肌細胞凋亡指數與老年對照組比較，差異無統計學意義(t=3.296，P=0.734)。

圖1 不同組大鼠心肌細胞TUNEL染色(×400)Fig 1 TUNEL staining of myocytes in different groups

2.2 骨骼肌細胞凋亡和Bcl-2、Bax的表達

與衰老模型對照組比較，3次/周運動組和6次/周運動組的骨骼肌細胞凋亡指數和Bax蛋白的表達均明顯降低，而Bcl-2蛋白的表達和Bcl-2與Bax比值明顯升高;與6次/周運動組相比，3次/周運動組骨骼肌細胞凋亡指數(t=2.928，P＜0.05)和 Bax的表達(t=3.478，P＜0.05)明顯降低，而Bcl-2表達(t=3.045，P＜0.05)和 Bcl-2與Bax比值明顯升高(t=4.643，P＜0.05)。見圖2、圖 3、表 1。

圖2 不同組大鼠骨骼肌細胞TUNEL染色(×400)Fig 2 TUNEL staining of skeletal muscle cells in different groups

表1 不同組骨骼肌細胞凋亡指數和Bcl-2、Bax蛋白的表達±sTab 1 Apoptosis index of skeletal muscle and exprssions of Bcl-2 and Bax in different groups

表1 不同組骨骼肌細胞凋亡指數和Bcl-2、Bax蛋白的表達±sTab 1 Apoptosis index of skeletal muscle and exprssions of Bcl-2 and Bax in different groups

a:P＜0.01，與對照組比較;b:P＜0.05，與6次/周運動組比較

±0.031 6次/周運動組(n=8) 44.680±2.060a 0.787±0.052a 0.877±0.025a 0.693±0.025a 3 次/周運動組(n=8) 41.130 ±2.175a，b 0.850 ±0.054a，b 0.790 ±0.014a，b 0.743 ±0.015a，b F值 8.452 10.348 16.756 5.639 P值/% Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax對照組(n=8) 48.960±4.163 0.590±0.031 1.053±0.042 0.620組別 凋亡指數0.007 0.006 0.004 0.009

圖3 免疫印跡法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達Fig 3 Western blot analysis of protein expressions of Bcl-2 and Bax

3 討論

D-半乳糖致衰老模型是我國學者基于衰老的代謝學說而復制的模型，系在一定的時間內給動物連續注射D-半乳糖，使其細胞內濃度增高，經醛糖還原酶催化形成半乳糖醇，后者不能被進一步代謝而堆積于細胞內，影響細胞滲透壓，導致細胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終致機體衰老。尹彤等［6］將自然衰老小鼠與D-半乳糖致衰老小鼠的重要臟器形態進行比較，結果顯示，D-半乳糖致衰老小鼠心臟病理組織學與自然衰老小鼠相似。Kajstura等［7］研究指出，24月齡小鼠的左心室心肌細胞凋亡發生率較16月齡小鼠增加了近2倍。這種心肌細胞凋亡隨齡性增加的現象，導致衰老小鼠的心肌細胞比青年小鼠減少了30%［7］。因此，衰老與否，可以用心肌細胞的凋亡來檢測，因其發生率隨年齡增加而增加，并且該現象僅局限于左心室的游離壁心肌細胞。本實驗對青年對照組大鼠、衰老模型組大鼠及老年對照組大鼠采用TUNEL法進行心肌細胞凋亡檢測。結果顯示，衰老模型組大鼠與老年對照組大鼠的心肌細胞凋亡指數均明顯高于青年對照組大鼠，且兩者比較相似，表明衰老模型大鼠可代替自然衰老大鼠進行本實驗的研究。

細胞凋亡是受多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因家族包括C-myc、抑癌基因P53等。Bcl-2家族蛋白在線粒體介導的凋亡通路中起重要調節作用，可分為2類:一類是抗凋亡，另一類是促凋亡。其中，Bcl-2和Bax這一對功能基因在細胞凋亡過程中起關鍵作用，兩者水平的高低與細胞凋亡直接相關。Bax增高，促進細胞凋亡;Bcl-2增高，則抑制細胞凋亡。Bax與Bcl-2兩者間的比例是決定細胞凋亡與否的關鍵因素［8］。Bax/Bcl-2＞1時，細胞趨向于凋亡;Bax/Bcl-2＜1時，細胞趨向于存活。隨著年齡的增加，增多的活性氧等物質可誘導促凋亡蛋白Bax與Bcl-2結合的復合物解離并轉運至線粒體，使線粒體膜形成孔洞，釋放出細胞色素C，從而激活整個凋亡途徑［9］。吳薇等［10］的研究顯示，衰老小鼠的 Bcl-2 表達減少，Bax表達升高，Bax/Bcl-2比例升高，提示Bcl-2蛋白家族介導的凋亡通路被激活，線粒體膜的完整性被破壞，釋放出促凋亡物質，促進細胞的凋亡。

運動訓練與細胞凋亡關系的實驗表明，適宜的運動強度不會引起細胞凋亡的增加;而力竭運動和超負荷運動時，大鼠細胞凋亡數量顯著增加，且運動強度與細胞凋亡的程度成正相關［11］。有氧運動可改變Bcl-2/Bax比值，從而影響骨骼肌細胞的凋亡。Song等［12］研究發現，老年大鼠在進行了12周的跑臺耐力訓練后，比目魚肌和腓腸肌中抗凋亡基因Bcl-2表達較對照組大鼠顯著增加，而Bax及Bax/Bcl-2比值均降低，比目魚肌和腓腸肌細胞凋亡指數隨之降低。Marzetti等［13］研究發現，28月齡的雄性Fischer 344大鼠骨骼肌凋亡率較8月齡雄性Fischer 344大鼠增加20.3%，而經過4周的跑臺運動后，其骨骼肌細胞凋亡指數降低。Siu等［14］對成年SD大鼠進行8周中等強度的運動訓練后，檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達情況，結果顯示，8周后運動組大鼠比目魚肌中Bcl-2表達較對照組增加，而Bax則較對照組下降。本研究表明，運動組經過12周的有氧運動訓練后，均出現Bax蛋白表達下降，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值升高，骨骼肌細胞凋亡指數降低，且3次/周運動組的骨骼肌細胞凋亡指數較6次/周運動組下降得更明顯，這說明隔日運動更有利于延緩骨骼肌細胞衰老。

綜上所述，長期有氧運動可以降低骨骼肌細胞凋亡，可能是由于有氧運動造成骨骼肌細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達的變化而引起的。

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