炎癥環境下巨噬細胞對小鼠骨髓間質干細胞遷移能力的影響

高碩，蔡夢潔，毛飛，楊婷婷，張潔，張玲，趙露露，坎吉克孜·阿不來提，錢暉，許文榮

(江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013)

間質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于大部分組織中的具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細胞［1］。在組織損傷等病理條件下，MSCs可以被動員到損傷部位，進而發揮抗炎和促損傷修復等作用［2］，我們前期的研究發現，MSCs

能在多種疾病模型如膠原誘導的小鼠關節炎［3］、腎缺血再灌注損傷［4］以及肝纖維化［5］中發揮治療作用。組織損傷往往伴有炎癥反應和免疫細胞的活化［6］。巨噬細胞作為炎癥反應的中心效應細胞和調節細胞，分泌多種細胞因子和趨化因子，是損傷局部微環境中關鍵因子的主要來源。因此，間質干細胞與巨噬細胞的相互作用逐漸成為研究的熱點。有研究表明，MSCs可以在心肌梗死［7］和脊髓損傷［8］

等疾病模型中影響巨噬細胞的表型和功能，從而發揮積極的治療作用。我們在前期的研究中也發現，

MSCs在體內能誘導巨噬細胞向M2型極化并影響其遷移數量，從而修復小鼠腎缺血再灌注損傷［9］。間質干細胞的遷移、活化以及功能的發揮均受到微環境的影響，而目前關于損傷環境下MSCs的遷移機制仍然不十分清楚。基于前期結果，我們考慮具有廣泛分泌功能的巨噬細胞可能對MSCs的遷移能力和功能發揮起到一定的作用。本實驗從炎性巨噬細胞角度出發，研究其對小鼠骨髓間質干細胞遷移功能的影響及細胞因子表達的改變，探尋炎癥條件下MSCs募集的機制，為進一步探討MSCs對于炎癥環境的反應及其抗炎和促損傷修復作用的機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 低糖 DMEM培養基、高糖DMEM培養基、胎牛血清(Gibco公司);細胞培養瓶(Nunc，Damerk公司);6孔板、transwell嵌合板(0.4 μm，8 μm)(Corning 公司);脂多糖(LPS，BY08069，Sigma-Aldrich公司);總RNA提取試劑 Trizol(Invitrogen公司);SYBR?Green實時定量PCR反應體系(ToYoBo公司)，反轉錄試劑盒(Thermo Scientific公司)。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(蘇州凈化廠)，二氧化碳培養箱(Forma公司)，倒置式生物顯微鏡(Nikon公司)，PCR儀、臺式離心機(Eppendorf公司)，CFX96定量PCR儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓間質干細胞的分離培養 分離方法參照之前報道［10］。6～8周雄性BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫學中心。斷頸處死小鼠，乙醇浸泡消毒2 min后在超凈臺中取股骨，PBS沖出骨髓細胞，洗滌1次后用含15%胎牛血清的低糖DMEM培養液重懸，以5×106/mL密度接種于細胞培養瓶中，置5%CO2，飽和濕度37℃的培養箱中培養。4 d后換液去除非貼壁細胞，以后每隔3天換液。待細胞生長至80%～90%融合度時消化傳代，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，經成骨成脂誘導分化鑒定后，3～5代的MSC用于下一步實驗。

1.2.2 巨噬細胞株RAW264.7的活化 小鼠巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學院上海細胞庫。將RAW264.7以2×105/mL密度接種于6孔板中，LPS(1 μg/mL)刺激12 h，顯微鏡下觀察細胞形態。PBS洗滌后直接收集每孔RAW264.7細胞于1 mL Trizol試劑中，－70℃保存。

1.2.3 RAW264.7與MSCs共培養實驗 MSCs以2×105/孔的密度接種于6孔板中，貼壁過夜后加入Transwell嵌合板(0.4 μm)，上室中加入的作用因素分別為正常培養液對照、RAW264.7細胞、含LPS的培養液以及 LPS刺激的 RAW264.7細胞。RAW264.7細胞數量與MSCs相同，LPS終質量濃度為1 μg/mL，作用12 h后直接收集下室每孔中的MSCs于1 mL Trizol試劑中，－70℃保存。

1.2.4 遷移實驗 在Transwell趨化小室(8 μm)上室種入含1×105MSCs的細胞懸液100 μL，下室的作用因素分別為正常培養液對照、RAW264.7細胞、含LPS的培養液以及LPS刺激的RAW264.7細胞。RAW264.7預先以1×105/孔的密度接種于24孔板中，培養液體積為600 μL，待細胞貼壁后在相應組別中加入LPS(1 μg/mL)。細胞置5%CO2，飽和濕度37℃的培養箱中培養12 h后將小室取出，擦去小室內細胞，PBS洗滌2次后用甲醇固定30 min，再用PBS洗滌1次，放入結晶紫染料中染色15 min，洗滌后計數拍照。

1.2.5 總RNA提取 將方法1.2.2和1.2.3中收集得到的標本進行總RNA提取。采用酚氯仿抽提法，紫外分光光度計檢測RNA溶液D(260/280 nm)比值均在1.8～2.0之間。參照說明書進行反轉錄反應，cDNA保存于－20℃備用。

1.2.6 RT-PCR檢測LPS刺激的RAW264.7表達炎癥因子和趨化因子的變化 反應體系為25 μL，包括 cDNA 1 μL、10 × 緩沖液 2.5 μL、dNTP(10 mmol/L)0.5 μL、rTaq 酶 0.2 μL、上下游引物各 0.5 μL，ddH2O補足至25 μL。30個循環后取擴增產物8 μL，與 2 μL 6 × 上樣緩沖液均勻混合后加樣于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，EB染色后用凝膠成像系統觀察拍照。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測共培養條件下MSCs的TGF-β1、IL-6及 MCP-1 mRNA 表達 反應體系包括:cDNA 1 μL、上下游引物各 0.4 μL(10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，10 μL 2 × SYBG Mix及8.1 μL去RNA酶的水。反應循環數為35。β-肌動蛋白作為內參，采用絕對定量的分析方法對結果進行計算。各引物序列見表1。

1.3 統計分析

實驗數據用GraphPad Prism 5.0軟件分析處理。兩組間比較采用t檢驗;多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 基因引物序列Tab1 Primer sequences of target genes

2 結果

2.1 小鼠骨髓間質干細胞的分離和體外擴增

原代培養的小鼠骨髓間質干細胞呈克隆性生長，貼壁，可見多角形和圓形細胞;傳代后的MSCs貼壁生長，以梭形為主，生長較均一。見圖1。

圖1 小鼠骨髓間質干細胞形態特征(×100)Fig 1 Cell appearance of mouse bone marrow MSCs

2.2 LPS活化的RAW264.7在 mRNA水平高表達IL-6、TNF-α、IL-1β 和 MCP-1

小鼠巨噬細胞株RAW264.7正常狀態下大部分呈圓形，貼壁生長;從400倍放大的圖片中可以看到，當受到LPS刺激后，細胞胞體變大，有偽足，胞質內有空泡(圖2箭頭所示)。從形態變化上看，與對照組靜息狀態下的巨噬細胞相比，LPS組巨噬細胞已經明顯活化。

圖2 小鼠巨噬細胞株RAW264.7在LPS刺激后的形態特征Fig 2 Appearance of RAW264.7 under the stimulation of LPS

RT-PCR電泳結果顯示，正常培養條件下的RAW264.7細胞不表達IL-6和IL-1β，低表達TNF-α和MCP-1。而LPS刺激后的RAW264.7細胞與對照組比較，IL-6(t=14.22，P ＜0.001)、TNF-α(t=33.6，P ＜0.001)、IL-1β(t=4.589，P ＜0.05)和 MCP-1(t=4.836，P＜0.01)在 mRNA水平均顯著升高，見圖3。RAW264.7單獨作用組和 LPS單獨作用組比，在LPS刺激的條件下RAW264.7能顯著增加MSCs遷移的數量，差異有統計學意義(q=9.457，P＜0.001和q=12.79，P＜0.001)。見圖4。

圖3 LPS對RAW264.7細胞表達炎癥因子的影響Fig 3 Effect of LPS on the inflammatory cytokine expression of RAW264.7

圖4 RAW264.7在炎性環境下對MSC遷移能力的影響(結晶紫染色×200)Fig 4 Effect of RAW264.7 on the migration of MSC in inflammation

2.3 炎性條件下RAW264.7增加MSCs遷移數量

對Transwell小室底部遷移的細胞進行顯微鏡下計數，結果顯示，與培養液對照相比，RAW264.7可誘導 MSCs的遷移(q=4.966，P＜0.01)。與

2.4 炎性條件下RAW264.7增加MSCs的TGF-β1、IL-6和MCP-1 mRNA表達水平

熒光實時定量 PCR結果顯示，LPS刺激后MSCs高表達IL-6(q=6.062，P＜0.01)和MCP-1(q=4.405，P ＜0.05)，TGF-β1 變化不明顯(P ＞0.05)。而在 LPS存在的條件下，RAW264.7與MSCs共培養能顯著增加 MSCs的 TGF-β1(q=4.287，P ＜0.05)、IL-6(q=6.836，P ＜0.01)和MCP-1(q=18.33，P＜0.001)mRNA表達水平。見圖5。

圖5 炎性環境下RAW264.7對MSCs表達TGF-β1、IL-6以及MCP-1基因的影響Fig 5 Effect of RAW264.7 on the expression of TGF-β1、IL-6 and MCP-1 genes of MSCs in inflammation

3 討論

間質干細胞來源于如骨髓、脂肪組織、肌肉組織以及臍帶華通膠等多種組織，具有多向分化潛能，在不同的刺激和培養條件下能分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞以及脂肪細胞［11］。近年來越來越多的研究發現了MSCs在組織修復再生中的積極作用，使其成為細胞治療中十分具有前景的選擇［12］。在組織損傷過程中，除了多向分化能力外，MSCs也具有抗炎和免疫調節作用，從而參與炎癥消退和組織再生。

間質干細胞的另一重要生物學特征是對局部環境的感知和反應。損傷環境可以刺激MSCs的活化，促進損傷局部和骨髓的MSCs募集到損傷部位，并分泌一系列可溶性因子，如前列腺素E2(PGE2)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)、IL-6及IL-10。這些因子作用于免疫細胞，從而發揮抗炎和免疫調節作用［13］。本實驗選取小鼠巨噬細胞為切入點，研究在LPS刺激的條件下巨噬細胞對MSCs遷移和細胞因子基因表達的影響。

目前在巨噬細胞對MSCs遷移能力的研究中存在著不同的觀點。Anton等［14］研究指出巨噬細胞條件培養上清含有IL-8、MCP-1等趨化因子，能夠促進MSCs的遷移，并使MSCs高表達IL-6和 CXCL10。而在Chen等［15］的研究中，誘導的單核細胞來源的巨噬細胞培養上清則能減少MSCs的遷移數量。本研究的不同點在于選擇RAW264.7細胞與小鼠骨髓MSCs體外 Transwell間接共培養，并且加入了LPS作為刺激因素，探討了在LPS存在的條件下巨噬細胞對MSCs遷移能力的影響和細胞因子表達的改變。研究結果表明，LPS刺激使RAW264.7細胞在基因水平高表達炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β和MCP-1，RAW264.7細胞能促進MSCs的遷移，這與Anton等的研究結果類似。而在LPS刺激條件下，RAW264.7細胞的這種作用則顯著增強，這可能與活化的巨噬細胞分泌的細胞因子發生改變有關。除了遷移能力，我們也觀察了LPS存在下巨噬細胞對MSCs表達細胞因子(TGF-β1、IL-6 及 MCP-1)的影響。我們發現在炎癥條件下，活化的巨噬細胞能在基因水平顯著增加 MSCs表達 TGF-β1、IL-6和MCP-1，即巨噬細胞可以在炎性環境下改變MSCs部分細胞因子的表達模式。有研究表明TGF-β1在組織重建的過程中能夠調控間質干細胞的募集［16］，而IL-6雖為炎癥因子，卻有促進細胞遷移和血管生成的作用［17－18］。作為典型的趨化因子，MCP-1能夠趨化單核細胞到達炎癥部位。也有研究認為MCP-1在間質干細胞的趨化中發揮重要作用［19］。尚需進一步實驗證明是否這些因子在巨噬細胞促進MSCs遷移過程中發揮直接作用，是否活化的巨噬細胞使MSCs自分泌增強也是其促遷移的機制之一。

綜上所述，我們的研究初步探討了炎癥環境下巨噬細胞對小鼠骨髓間質干細胞遷移和部分細胞因子表達的影響，在今后的研究中我們將進一步關注炎性巨噬細胞影響MSCs遷移過程中的關鍵因子，以及體內炎癥或損傷微環境下巨噬細胞參與的MSCs遷移和修復作用，從而為探討MSCs在組織損傷修復過程中作用機制提供實驗依據。

［1］ Caplan AI.Mesenchymal stem cells［J］.J Orthop Res，1991，9(5):641－650.

［2］ Shi Y，Su J，Roberts AI，et al.How mesenchymal stem cells interact with tissue immune responses［J］.Trends Immunol，2012，33(3):136 －143.

［3］ Mao F，Xu WR，Qian H，et al.Immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells in collagen-induced mouse arthritis［J］.Inflamm Res，2010，59(3):219 －225.

［4］ Chen Y，Qian H，Zhu W，et al.Hepatocyte growth factor modification promotes the amelioration effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells on rat acute kidney injury［J］.Stem Cells Dev，2011，20(1):103 －113.

［5］ Xu H，Qian H，Zhu W，et al.Mesenchymal stem cells relieve fibrosis of Schistosoma japonicum-induced mouse liver injury［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2012，237(5):585－592.

［6］ Medzhitov R.Origin and physiological roles of inflammation［J］.Nature，2008，454(7203):428－435.

［7］ Dayan V，Yannarelli G，Billia F，et al.Mesenchymal stromal cells mediate a switch to alternatively activated monocytes/macrophages after acute myocardial infarction［J］.Basic Res Cardiol，2011，106(6):1299 －1310.

［8］ Nakajima H，Uchida K，Guerrero AR，et al.Transplantation of mesenchymal stem cells promotes an alternative pathway of macrophage activation and functional recovery after spinal cord injury［J］.J Neurotrauma，2012，29(8):1614－1625.

［9］ Li W，Zhang Q，Wang M，et al.Macrophages are involved in the protective role of human umbilical cord-derived stromal cells in renal ischemia-reperfusion injury［J］.Stem Cell Res，2013，10(3):405 －416.

［10］ 毛飛，高碩，錢暉，等.LacZ轉基因小鼠間充質干細胞的分離培養和生物學特性研究［J］.臨床檢驗雜志，2011，29(7):542－544.

［11］ Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284(5411):143－147.

［12］ Caplan AI.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine［J］.J Cell Physiol，2007，213(2):341 －347.

［13］ Singer NG，Caplan AI.Mesenchymal stem cells:mechanisms of inflammation ［J］.Annu Rev Pathol，2011，6:457－478.

［14］ Anton K，Banerjee D，Glod J.Macrophage-associated mesenchymal stem cells assume an activated，migratory，pro-inflammatory phenotype with increased IL-6 and CXCL10 secretion［J］.PLoS One，2012，7(4):e35036.

［15］ Chen C，UludagˇH，Wang Z，et al.Macrophages inhibit migration，metabolic activity and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro［J］.Cells Tissues Organs，2012，195(6):473－483.

［16］ Zhang F，Tsai S，Kato K，et al.Transforming growth factor-β promotes recruitment of bone marrow cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells through stimulation of MCP-1 production in vascular smooth muscle cells［J］.J Biol Chem，2009，284(26):17564－17574.

［17］ Wan M，Li C，Zhen G，et al.Injury-activated transforming growth factor β controls mobilization of mesenchymal stem cells for tissue remodeling［J］.Stem Cells，2012，30(11):2498－2511.

［18］ Yew TL，Hung YT，Li HY，et al.Enhancement of wound healing by human multipotent stromal cell conditioned medium:the paracrine factors and p38 MAPK activation［J］.Cell Transplant，2011，20(5):693 －706.

［19］ Botto S，Streblow DN，DeFilippis V，et al.IL-6 in human cytomegalovirus secretome promotes angiogenesis and survival of endothelial cells through the stimulation of survivin［J］.Blood，2011，117(1):352 －361.