補中益氣丸對糖尿病大鼠NO、PGs、MAN1A1相關胃黏膜損傷的修復

張永斌，劉曉秋，陳 嘉，高 欣，伍軍軍，李守軍

（1.廣州中醫藥大學實驗動物中心，廣東 廣州510405；2.廣州中醫藥大學脾胃研究所，廣東 廣州510405；3.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642）

糖尿病胃腸損傷是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的常見并發癥之一，在糖尿病者中可占到20%以上［1］，其胃腸并發癥常影響口服降糖藥物和其他藥物的療效，以及食物的代謝吸收，進而影響糖尿病的進程［2］。糖尿病胃腸損傷的發病機制可能跟糖尿病狀態下的氧化應激及糖鏈缺陷有關。一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）存在結構性NOS（cNOS）和誘導型 NOS（iNOS），催化產生一氧化氮（Nitric oxide，NO）和前列腺素（prostaglandins，PGs），在保全黏膜完整性方面起關鍵性作用，但另一方面NO和PGs產生過多，將導致胃腸黏膜損傷［3－4］。α－甘露糖苷酶（alpha－mannosidase，MAN1－A1）是一種參與糖鏈合成和代謝的重要蛋白酶，是一類關鍵性糖苷酶，在糖鏈的形成過程和糖蛋白在溶酶體的降解過程中發揮重要作用［5］，MAN1A1活性降低會影響機體合成復雜型糖鏈，導致N－糖鏈缺陷，因而致細胞增生、移行缺陷及細胞的死亡，因而影響組織損傷修復［6－8］。本研究旨在建立糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，動態觀察補中益氣丸對糖尿病大鼠NO、MAN1A1、PGs和AMS的影響，探討糖尿病狀態下胃黏膜損傷的發病機制及補中益氣丸的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠100只，體重180g～220g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑 補中益氣丸顆粒：九芝堂股份有限公司生產，批號：201108005；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）：美國Sigma公司生產，批號：110610；NO和淀粉酶（AMS）試劑盒：南京建成科技有限公司，批號：20120604，20120606；1，2－α－甘露糖苷酶（MAN1A1）、大鼠前列腺素 E2（PGE2）和大鼠6－酮前列腺素F1α（6－keto－PGF1α）ELISA 試劑盒：武漢華美生物工程試劑有限公司生產，批號：LotA28010249、LotC0302020148、LotB25011315。

1.3 糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型的造模方法 大鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射STZ（用0.1mol/L，pH值4.2的檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖溶液配制成10mg/ml的溶液），劑量55mg/kg，在STZ注射72 h后監測隨機血糖，連續3次血糖值≥16.8mmol/L，且有多飲、多尿，多食癥狀，入選糖尿病動物模型，糖尿病造模同時灌胃30%乙醇，劑量10mL/kg，連4周。

1.4 動物分組及處理 大鼠隨機分為3組：正常組26只，糖尿病模型組35只，糖尿病＋補中益氣丸組39只（簡稱中藥組，下同）。各組動物從試驗第5周起開始給藥，正常組及模型組等體積生理鹽水（20 mL/kg·d）灌胃，連12周，中藥組給予補中益氣湯灌胃，3.75g/kg·d，連12周。

1.5 標本提取及處理 試驗第8周、12周和16周末，動物空腹過夜，第2天早晨每組處死動物6只，腹主動脈采血5mL，3 000r/min離心10min，取上清存于－20℃冰箱待測；采血后取胃，沿胃大彎剪開并翻轉胃腔，漂洗于4℃生理鹽水，除去胃腸腔內容物，濾紙吸干，計算胃黏膜損傷指數并拍照；剪1/3胃，稱重，用冷PBS洗滌2次，低速勻漿，過200鉬鎳篩后，4℃低溫28 000r/min離心20min，取上清液－80℃低溫保存，待測。

1.6 測定指標和方法：

1.6.1 胃黏膜損傷指數的測量 按Guth標準計算胃黏膜損傷指數，無可見損傷為0分；點狀出血為1分；線狀出血、長度＜1mm為2分；線狀出血、長度1～2mm為3分；線狀出血、長度2～4mm為4分；線狀出血、長度＞4mm為5分；線狀出血、寬度＞1mm時分值×2。

1.6.2 胃黏膜組織病理學分析 取1/3胃組織作10%甲醛固定，行H.E.染色觀察。

1.6.3 NO含量、α－甘露糖苷酶活性檢測 ELISA法測定血清α－甘露糖苷酶、硝酸還原酶法測定血清NO含量。

1.6.4 淀粉酶活性檢測 按試劑盒方法測定血清和胃黏膜勻漿液的AMS活性（紫外分光光度法）。AMS活性測定中定義：100mL血清或每毫升組織勻漿液在37℃與底物作用30min，水解10mg淀粉為一個單位。

1.6.5 前列腺素 E2、6－酮前列腺素 F1α含量測定ELISA法測定胃黏膜勻漿液前列腺素E2、6－酮前列腺素F1α含量。

1.7 統計學分析 應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，計量資料以±S表示，多樣本均數比較采用單因素方差LSD檢驗。

2 結果

2.1 模型建立情況 注射STZ后，造模大鼠中有72%出現血糖持續升高并陸續發生死亡（空腹血糖≥16.8mmol/L），毛色枯黃無光澤、毛態豎立、精神倦怠、體型消瘦、飲水排尿增多、懶動等癥狀，30%乙醇灌胃4周后剖取鼠胃，模型組和治療組均發現點狀、條索狀的胃黏膜糜爛、出血灶，試驗16周時，模型組胃壁變薄、變輕，見有潰瘍（見后插－彩版圖1），H.E.染色結果顯示，模型組胃黏膜層上皮細胞黏液變薄、缺失、細胞間隙變大）、有輕度的壞死（見后插－彩版圖2）。從血糖水平、胃黏膜肉眼觀察和病理觀察結果顯示，初步建立了較穩定的糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型。

2.2 各組大鼠胃黏膜損傷指數的比較 模型組和治療組均發現點狀、條索狀的胃黏膜糜爛、出血灶，隨病程進展，兩組胃壁逐漸變薄，變輕，見有潰瘍，治療組經補中益氣丸治療后，較模型組顯著降低（見表1）。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數的比較 （n＝6）

2.3 各組大鼠血清NO和1，2－α－甘露糖苷酶含量動態比較 模型組血清NO含量在試驗第12周、16周時較正常組及中藥組顯著提高（P＜0.01或P＜0.05）；模型組血清 MAN1A1有降低的趨勢，在第12周、第16周較正常組顯著降低（P＜0.05），中藥組則逐漸提高，在第12周和第16周時與正常組已無顯著差異（P≥0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清NO、MAN1A1水平的動態比較 （n＝6）

2.4 各組大鼠血清及胃黏膜淀粉酶活性比較 模型組和中藥組胰腺AMS活性較正常組極顯著降低（或P＜0.05），中藥組降低更甚于模型組，但無統計學意義（P≥0.05）；模型組和中藥組血清淀粉酶活性較正常組極顯著降低（P＜0.01），但均呈現逐漸提高，在實驗第16周時，中藥組AMS活性較模型組顯著提高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清和胰腺組織的AMS活性動態比較 （n＝6）

2.5 各組大鼠胃黏膜前列腺素E2和6－酮前列腺素F1α的動態比較 模型組PGE2含量較正常組極顯著降低（P＜0.05），中藥組經補中益氣丸治療后在第12周和第16周，時較模型組顯著提高（P＜0.05）并和正常組已無顯著差異（P≥0.05）；模型 組 6－keto－PGF1α含量較正常組極顯著提高（P＜0.01），中藥組逐步恢復，較模型組顯著降低（P＜0.05），與正常組無顯著差異（P≥0.05），見表4。

表4 各組大鼠胃黏膜PGs的動態比較 （n＝6）

3 討論

本試驗首次采用腹腔注射STZ結合30%乙醇灌胃方法制作糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，糖尿病大鼠普遍出現胃黏膜充血和點狀出血，隨病程延長，胃壁變薄。從胃黏膜損傷肉眼觀察結果和病理學檢查結果中顯示，本試驗已成功制作出糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型。

No和PGs均由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS ）和環氧化酶（cyclooxygenase，COX）催化產生，共同構筑黏膜防御系統，在保全黏膜完整性方面起關鍵性作用，但另一方面NO和PGs產生過多或過少，將導致胃腸黏膜損傷。研究發現［9］，NO與糖尿病慢性并發癥密切相關，在糖尿病的早期表現為NO水平的升高，而在晚期則為NO水平的下降。本試驗結果顯示，模型組血清NO濃度明顯高于正常對照組，在12周達到最高，16周時有所下降，可推測造模12周左右的大鼠處于糖尿病中期；糖尿病代謝紊亂使NO大量合成，同時模型組血清PGE2含量降低，而6－keto－PGF1α含量升高，NO和PGs的共同作用，使模型組的胃黏膜損傷指數上升。

N－糖基化是機體蛋白質翻譯后的一種重要的修飾過程。MAN1A1是一種參與糖蛋白合成和代謝的重要蛋白酶，是一類關鍵性糖苷酶，由很多成員組成，主要存在于內質網、高爾基體、溶酶體中，它在聚糖從高甘露糖型轉化成復雜型結構中起重要的作用，α－甘露糖苷酶活性降低，會影響機體合成復雜型糖鏈，導致糖鏈缺陷，因此，測定MAN1A1活性，可反映出N－糖鏈的合成是否存在缺陷。淀粉酶主要由唾液腺和胰腺分泌，是胰腺外分泌主要的分泌顆粒酶原，研究發現，N－糖基化影響淀粉酶分泌，即C－結構域N－糖基化的缺陷會抑制大鼠胰腺α－淀粉酶的分泌和活性［10］。本試驗結果顯示，模型組血清1，2，α－甘露糖苷酶活性、血清AMS和胰腺AMS均比正常組明顯下降，反映出N－糖鏈的合成存在缺陷。MAN1A1活性降低會影響機體合成復雜型糖鏈，導致N－糖鏈缺陷，因而致細胞增生、移行缺陷及細胞的死亡，因而影響組織損傷修復。

糖尿病屬于中醫“消渴”的范疇，補中益氣湯為益氣健脾經方，其成分為黃芪、黨參、甘草、白術、當歸、升麻、柴胡和陳皮。臨床上應用補中益氣湯加味治療胃潰瘍、糖尿病性胃輕癱、糖尿病性腹瀉等病證，均取得了較好的療效［11－15］。王氏等［16］研究認為，本方益氣健脾的作用可能與其促進胰酶的分泌作用有關。本試驗結果顯示，各組糖尿病大鼠均有胃黏膜充血和點狀出血，經補中益氣湯治療后，治療組的胃黏膜損傷情況有所改善，可有效提高血清NO、AMS和MAN1A1活性，提高胃黏膜PGE2和降低6－keto－PGF1α的含量，但不能提高胰腺 AMS的活性，血清AMS含量升高主要來源于唾液腺，表明補中益氣湯可能主要影響唾液AMS活性，尚需進一步求證。糖尿病狀態下胃黏膜損傷的發病機制可能跟糖尿病狀態下的NO、MAN1A1、PGs缺陷有關，表現在NO、PGs代謝紊亂，MAN1A1和淀粉酶活性降低，而補中益氣湯對以上異常有顯著治療作用，可能是通過促進NO生成、升高 MAN1A1活性，因而促進蛋白N－糖基化。

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