青海部分地區(qū)人和動物血清弓形蟲抗體檢測

馬利青，韓秀敏，蔡其剛，鄭 宜，陸 艷，王戈平，葉成玉，牛小迎

（1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧810016；2.青海省地方病預(yù)防控制所，青海 西寧810007）

弓形蟲病，是由龔地弓形蟲（Toxophasmagondii）所引起的人畜共患病。蟲體可以感染溫血動物的許多屬，包括人。動物通過吃了已經(jīng)被貓科動物糞便污染的肉，或者通過母體傳給胎兒的方式感染，未經(jīng)加工的生肉也是造成該病在人群中傳播的原因，同時手被貓糞便污染也是風(fēng)險因素。估計在全世界約有1/3的人口中存在弓形蟲的感染［1］。美國疾病控制和預(yù)防中心報道了從1999年到2004年的血清流行病學(xué)檢測結(jié)果，血清陽性率為10.08%，處于分娩階段的婦女的陽性率為11%左右（15歲～44歲）［2］。為了解弓形蟲在青海省這樣一個相對封閉的高海拔地區(qū)人群和不同動物之間的流行情況，我們于2010年5～10月份，利用ELISA診斷方法，對近期所收集的青海地區(qū)的孕婦、藏系綿羊、馬、藏獒、駱駝、喜馬拉雅旱獺、高原鼠兔、中華鼢鼠、藏羚羊和實驗小鼠的血清樣品進(jìn)行檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 抗原 弓形蟲的標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清由日本國家原生動物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧科學(xué)院所生物技術(shù)研究室保存。重組的弓形蟲表面融合蛋白（rSAG1），按照管剛等介紹的方法進(jìn)行［3］。rSAG1簡介如下：由基因編碼的T.gondii表面蛋白1（SAG1）被克隆到pGEX－4T－3質(zhì)粒上，再表達(dá)到Escherichiacoli（E.coli）上，最后獲得rSAG1。

1.2 被檢血清的采集和處理 1 090份被檢血清分別來自孕婦的51份，藏系綿羊的220份，藏獒的192份，馬的314份，駱駝的144份，喜馬拉雅旱獺的68份，高原鼠兔的39份，中華鼢鼠的12份，藏羚羊的2份，實驗小鼠的48份。采血時均空腹、頸靜脈或心臟或眼眶眼底采集，采集后擺成斜面，置4℃冰箱5h后，放在室溫待血清析出后收集血清，－20℃冷凍保存待檢。

1.3 其他試劑和耗材 均購自國內(nèi)和Sigma公司供應(yīng)商。

1.4 ELISA 診斷

1.4.1 抗原的包被 抗原GST－SAG1t和GST，按5μg/mL劑量加到包被液中（50mmol/L carbonate bicarbonate Buffer，pH值9.6），混勻后加到96孔平底微量板（Castor）的孔里，每孔50μL，并且在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的 PBS（100mL 10×PBS＋900mL蒸餾水＋0.5mL Tween 20）沖洗1次后，殘留的粘附物的部位用含3%脫脂乳的封阻液（3g脫脂乳粉＋90mL蒸餾水＋10mL 10×PBS）進(jìn)行封阻，每孔100μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1h。1.4.3 加樣 隨后微量板用沖洗液沖洗6次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1h。

1.4.3 加二抗 用沖洗液沖洗6次后，針對不同來源的血清樣品，在封阻液中按1∶4 000滴度稀釋辣根過氧化物酶結(jié)合了人、羊、犬、馬的IgG抗體兔抗人、羊、犬，山羊抗馬的二抗，以及Protein A，稀釋后每孔加50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1h。

1.4.4 底物 用沖洗液沖洗6次后，每孔加100 μL底物（每毫升底物中含有0.3μg ABTS，0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液pH 值4.0和0.003%H2O2），在室溫陰暗處放置1h后讀數(shù)。

1.4.5 讀數(shù) 用 Wellscan MK 3酶標(biāo)讀數(shù)儀 （Labsystems Dragon，F(xiàn)inland）在光吸收值OD415nm條件下測定光吸收值（OD）。

1.4.6 判定標(biāo)準(zhǔn) ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GST－SAG1t孔和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩個孔之間的差值為該被檢樣品的OD值。兩孔陽性血清對照孔的平均值必須大于0.1；兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.1；兩孔待檢樣品的平均值等于或大于0.1為陽性，低于0.1為陰性。

2 檢測結(jié)果

利用基于重組的弓形蟲表面蛋白1（rSAG1）的ELISA診斷試劑盒，對1090份來自青海省的部分孕婦、藏系綿羊、馬、藏獒、駱駝、喜馬拉雅旱獺、高原鼠兔、中華鼢鼠、藏羚羊和實驗小鼠的血清樣品，進(jìn)行弓形蟲特異性抗體的檢測，檢出56份陽性血清，平均陽性率為5.14%，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 青海省部分人和動物弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查

3 小結(jié)與討論

3.1 通過調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在所調(diào)查的部分孕婦、藏系綿羊、馬、藏獒、駱駝、喜馬拉雅旱獺、高原鼠兔、中華鼢鼠、藏羚羊和實驗小鼠的血清樣品，除了在駱駝、藏羚羊和實驗小鼠中未檢出陽性血清外，其他樣品中均檢出了，并且在部分孕婦血清中有較高的感染率（7.84%），這個結(jié)果與于恩庶報道的5%～10%的感染率基本接近［4］。

3.2 我們已經(jīng)用所構(gòu)建的ELISA診斷試劑盒，已經(jīng)對牛［5］、羊［6］、犬［7］等動物進(jìn)行了檢測，而在本次試驗中又對馬、駱駝、喜馬拉雅旱獺、高原鼠兔、中華鼢鼠、藏羚羊和實驗小鼠進(jìn)行了檢測，在檢測中對除了人、馬、牛、羊、犬和實驗小鼠使用相對應(yīng)的結(jié)合了辣根過氧化物酶的二抗外，其他動物均應(yīng)用了Protein A作為第二抗體。

3.3 部分學(xué)者已經(jīng)對青海省所屬區(qū)域內(nèi)的人畜進(jìn)行過弓形蟲感染率的調(diào)查，但是同時對一定范圍內(nèi)的人群、家養(yǎng)動物、部分野生動物和實驗動物中弓形蟲的血清流行病學(xué)沒有進(jìn)行過調(diào)查，為此本試驗的旨意在于通過本次調(diào)查，探究我省人群、家畜和野生動物之間弓形蟲的感染情況，為今后控制該病提供一定的流行現(xiàn)狀基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］ Montoya J，Liesenfeld O.“Toxoplasmosis”［S］.Lancet，2004，363（9425）：1965－1976.

［2］ ones J L，Kruszon－Moran D，Sanders－Lewis K，etal.“Toxoplasma gondii infection in the United States，1999－2004，decline from the prior decade”［J］.Am J Trop Med Hyg，2007，77（3）：405－410.

［3］ 管剛，牛小迎，馬利青.豬弓形蟲病的ELISA診斷及試劑盒的建立［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44（6）：83－84.

［4］ 于恩庶，中國弓形蟲病［M］.香港：香港亞洲醫(yī)藥出版社，2000：159－171.

［5］ 陸艷，馬利青.青海省牛弓形蟲病的ELISA診斷及試劑盒建立［J］.中國動物檢疫，2009，26（10）：40－41.

［6］ 蔡其剛，馬利青.青海省綿羊弓形蟲病的ELISA診斷方法的建立及血清學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（3）：39－40.

［7］ 牛小迎，陸艷，馬利青.青海省西寧地區(qū)弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查［J］.中國動物檢疫，2009，26（07）：43.