奶山羊乳腺組織5－HTR7基因的克隆與序列分析

江青東，王慧杰，陳 寧

（1.鄭州牧業工程高等專科學校繼續教育學院，河南 鄭州450011；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，新疆 烏魯木齊830000）

5－羥色胺（5－HT）是一種吲哚衍生物，分子式C10H12N2O。5－羥色胺能與酸作用生成結晶鹽 。其鹽酸鹽熔點167℃～168℃ ；苦味酸鹽熔點185℃～189℃。5－羥色胺在腦組織中的濃度較高，它是調節神經活動的一種重要物質［1－2］。同時美國辛辛那提大學醫學院的納爾遜·霍斯曼和其他研究人員發現，5－羥色胺會發出一種信號，降低奶牛的產奶量。只要抑制奶牛乳腺中的5－羥色胺含量，就可以將產奶量提高15%。其機理是乳腺上皮合成的5－HT抑制了PRL對乳腺的刺激，影響乳腺的發育和泌乳，抑制PRL刺激的乳蛋白基因表達，這些作用可被5－HTR拮抗劑二甲麥角新堿阻斷，提示是經過5－HTR產生的［3－7］。目前，針對哺乳動物5－HTR基因在乳腺組織中的分布尚未報道，本試驗通過基因文庫電子拼接及RTPCR技術克隆了奶山羊乳腺組織中5－HTR7基因，為進一步研究5－HT在其受體的作用下對哺乳動物牛的乳腺發育和調控泌乳方面提供理論基礎。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集 取泌乳期奶山羊（購自陜西薩能奶山羊養殖基地）乳腺組織，入液氮速凍，置－80℃保存保存待測。

1.2 酶與試劑 AMV 反轉錄酶、RNase－Inhibitor、Oligo（dT）、TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、Buffer、DNA Marker、pMD－19T 載 體、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、E.coliJM109感受態細胞、T4DNA連接酶等，均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；動物組織RNAout，購自綿陽天澤基因工程有限公司。

1.3 PCR引物的設計及合成 根據GenBank公布的牛和鼠的5－HT受體－7基因的cDNA序列，利用Primer5.0引物設計軟件和BLAST鑒定設計一對克隆引物。上游引物：5′－TCCTGACGCTCATCACGCTGCTG－3′，下游引物：5′－GAGAGAGTTTGCATAGCCCAGCCA －3′，預期片段810bp，引物由北京三博遠志生物科學技術有限公司合成。

1.4 奶山羊乳腺組織總RNA的提取及含量測定按照動物組織RNAout試劑盒的說明進行提取乳腺組織總RNA：取0.1g乳腺組織，采用動物組織RNAout提取總RNA，溶解于20μL DEPC水中；取5 μL乳腺組織RNA提取液（其余－80℃保存備用），用0.8%瓊脂糖凝膠電泳（130V，15min），紫外燈下觀察，檢查其完整性。紫外分光光度計測定OD260和OD280，檢測RNA的純度及計算含量（圖1）。

圖1 乳腺組織中總RNA電泳結果

1.5 RT－PCR法 cDNA合成反應體系：模板RNA 2μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）4μL，RNase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，Oligo（dT）18（50 pmol/L）1μL，AMV（5U/μL）0.5μL，DEPC－H2O 6 μL，總體積20μL。混勻，室溫放置10min，入42℃1 h，置－20℃冰箱備用。

PCR擴增體系：10×Buffer（Mg2＋）5μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）6μL，25mmol/L MgCl26μL，rTaq（5U/μL）0.5μL，上、下游引物（20pmol/L）各1μL，cDNA 4μL，ddH2O 14μL，總體積50μL。

PCR反應程序：95℃變性5min；95℃10s，52℃20s，72℃30s，共35個循環；最后72℃延伸10min。反應完成，分別取5μL PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠、100V、30min電泳。凝膠成像系統照像并檢測PCR產物積分光密度（IOD）值，用各基因與β－actin的比值相對定量轉錄水平。

PCR產物回收：目的片斷的回收參照上海生工生物工程技術服務有限公司UNIQ－10膠回收試劑盒說明書進行。

目的基因的克隆與測序：將PCR擴增產物純化后，與pMD－19T載體連接，構建克隆載體。轉化到JM109感受態細胞，進行藍白斑篩選，重組質粒通過酶切和PCR鑒定：1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果；陽性菌液送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.6 序列分析 利用BioXM 2.6、DNAStar軟件及Blast、Smart進行分析。

2 結果與分析

2.1 RT－PCR擴增及克隆 RT－PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了長度為810bp的目的片段（圖2）。菌落PCR鑒定得到同樣大小的目的片段（圖3）。

2.2 奶山羊5－HTR7基因的克隆序列 測序結果及推測的氨基酸序列如圖4。克隆的奶山羊5－HTR7基因包含一個完整的開放閱讀框架（open reading frame，ORF），長為810bp，酸性氨基酸：46個；堿性氨基酸：70個；蛋白質分子量為：42.20 kDa，等電點：11.773。

圖4 奶山羊5－HTR7的cDNA序列及其推測的氨基酸序列

2.3 奶山羊5－HTR7基因的種屬差異分析DNAStar分析發現，奶山羊5－HTR7基因的ORF與猴（NM－00193683）、大熊貓（XM－002926833）、豬（NM－214101）、大 猩 猩 （ABO37534）和 人 （NM－000866）的同源性分別為21.3%、19.8%、20.7%、89.2%和76.2%（圖5），推測氨基酸序列與人和大猩猩在基因進化方面可見，羊和人的同源性最高，其次是與人。Blastp序列比較分析，奶山羊5－HTR7基因推測氨基酸序列與人和大猩猩的同源性（Identities）分別為73%和64%，相似性（Positives）分別為81%和69%；Smart分析發現，奶山羊5－HTR7基因推測氨基酸序列信號肽與人、牛5－HTR7基因氨基酸序列信號肽均為1aa～17aa，SapB結構域均為59aa～126aa，結構特征與人、牛的5－HTR7結構特征相一致。這也許就是5－HTR7基因起重要生物學作用的蛋白片段，而這需要進一步的深入研究。

圖5 奶山羊5－HTR7基因序列與猴、大熊貓、大猩猩和人5－HTR7基因序列的比較

3 討論

5－HT分布全身，尤其在血小板和腸內更多，腦內主要是在中縫核及延腦中。迄今為止已發現人類5－HT受體至少有7大類，這7種類型又可進一步分成若干亞型［8－11］。按照受體轉導方式的不同，可分為G蛋白偶聯體超家族和配體門控離子通道族兩大類。5－HT7受體的結構類似于5－HT6，有7個疏水的跨膜區，但含有一些保守性結構，有1個內含子，第5個跨膜區有保守的單丙氨酸殘基。5－HT7在大腦中有著廣泛的分布，在冠狀動脈、胃腸道系統等周圍組織中也很豐富［12］。目前5－HT受體激動劑和抑制劑都是用于神經系統的藥物，治療精神疾病［13－14］。況且沒有專門針對5－HT 受體的藥物，將這些化學藥物用于奶牛，一是會影響奶牛的健康，最重要的是這些化合物會在奶里殘留，進而影響人的健康。本試驗通過牛和鼠在其他組織中的5－HTR7基因序列設計同源性引物采用RT－PCR方法克隆出奶山羊乳腺組織中5－HTR7的基因組全序列，據報道，5－HT在乳腺組織中主要與5－HTR7相互作用來影響哺乳動物的泌乳量，這將對下一步研究特異性針對乳腺中的5－HT受體，通過基因敲除技術，是一種綠色環保的藥物，來提高哺乳動物的產奶量和養殖戶的經濟效益奠定理論和技術基礎。

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