TEAD1和YAP1對牛干擾素Tau基因表達調控的試驗

張金鳳，侯振中

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030）

反芻動物的干擾素Tau（IFNT）最初是作為一種抗黃體溶解因子被發現的［1］。后經基因及氨基酸序列分析被歸類為Ⅰ類干擾素［2］。研究表明，在胚胎著床前期，反芻動物的胚胎分泌IFNT作用于子宮內膜并抑制黃體溶解素－前列腺素F2α（PGF2α）的釋放，進而維持黃體的功能。此外，IFNT可以同其他的干擾素一樣誘導多種干擾素刺激基因（IFN－stimulated genes，ISGs）在子宮內膜表達［3］，這些基因與孕酮誘導的基因共同作用于子宮內膜，調節與子宮容受性相關的一系列生理過程，如胚胎與子宮腔表面的接著、胚胎的生長發育、母體免疫系統調節、子宮間質細胞分化、子宮內膜血管發育、營養物質向子宮腔的運輸及母胎間的分子交換等，對反芻動物妊娠的成功建立起著決定性的作用［4］。但IFNT基因表達的分子調控機制一直未被完整的建立起來。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物樣品 本試驗中所用的動物樣品為日本黑毛和牛和荷斯坦母牛，由東京大學實驗動物中心提供。涉及的所有動物操作都經過東京大學和Zen－noh公司胚胎移植中心的實驗動物委員會認可。同期發情、超數排卵及胚胎移植方法見文獻［5］。首先對日本黑毛和牛進行超數排卵及人工授精，收集妊娠第7天的胚胎（Day0＝發情當天）。將收集到的胚胎通過非外科手段移植至處于發情期第7天的荷斯坦母牛的子宮角內。將處于生長期的妊娠第17、20、22天胚胎通過非外科的子宮沖洗方式獲得。子宮沖洗后胚胎，1 000r/min離心5min，速凍保存，并送實驗室待檢。

1.1.2 細胞樣品 人絨毛膜癌JEG3細胞（HTB36，American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD），用于本試驗中的質粒轉染及熒光素酶分析。培養液組成：DMEM（Invitrogen，Carlsbad，California）；10%v/v胎牛血清（JRH Bi－osciences，Lenexa，KS）；抗生素/抗霉菌素溶液（Invitrogen公司）。培養條件：37℃，5%CO2細胞培養箱（SANYO公司，型號：MCO－19AIC）。

1.1.3 用于PCR的引物 本試驗中用到的引物參照GenBank上各全序列確定引物，由Life Technologies Japan Ltd合成，具體引物見表1。

表1 用于PCR的引物

1.1.4 本試驗中用于熒光素酶分析的質粒 見表2。

表2 用于熒光素酶活性分析的質粒

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR分析 將制備好的RNA反轉錄模板－cDNA 3μL用ExTaq聚合酶試劑盒按照說明書進行PCR分析。反應體系：0.5UExTaq聚合酶，1xExTaqBuffer，0.2μmol/L 上 下 游 引 物，0.2 mmol/L dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸），cDNA 3 μL，最后用分子生物學級超純用水調整反應體積為20μL。反應條件：（1）95℃反應2min；（2）95℃30 s；（3）57℃30s；（4）72℃30s；（5）72℃10min；（6）4℃ ∞。其中（2）～（4）步重復30循環。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙錠顯色，在紫外光照射儀下觀察并記錄結果。

1.2.2 質粒構建 本試驗中以pGL 3為質粒載體，IFNT基因5′端上游區域切除或點突變以制備各種長度的IFNT熒光素酶報告基因。牛IFNT熒光素酶報告基因構建及轉染方法見文獻［6］，具體的熒光素酶報告質粒如圖1所示。

圖1 IFNT熒光素酶報告基因構成

1.2.3 熒光素酶分析 使用熒光素酶檢測試劑盒（Promega），用熒光免疫分析儀（Perkin Elmer，型號：1420），按照廠家說明書進行操作。

1.3 統計學分析 所有的定量數據以均數±標準差（±SD）表示，使用SPSS 16.0統計軟件進行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著；并通過Excel 2007進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 牛著床前期胚胎中TEAD家族基因表達情況如圖2所示。

圖2 牛著床前胚胎中IFNT基因及TEAD家族基因的表達情況

本試驗中，取牛著床前胚胎（妊娠第20天），通過PCR方法檢測TEAD家族基因表達情況。由圖2可以看出，牛著床前胚胎中，TEAD家族各成員都有表達，但是TEAD2的表達量極少。

2.2 牛各器官中TEAD家族基因表達 本試驗中，取牛各器官組織，通過PCR方法檢測TEAD家族基因表達情況。表達結果如圖3所示。

由圖3可以看出，TEAD2在各器官表達量極少，甚至不在肝臟和皮膚組織中表達；其余TEAD家族各成員在各種器官（如心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、皮膚、乳腺、胎盤）中都有表達，但是TEAD1的表達量相對較少。

2.3 牛胚胎及各器官中YAP1基因的表達 牛胚胎及各器官中YAP1基因表達情況如圖4所示。

圖3 牛各器官中TEAD家族各成員的表達情況

本試驗中，取牛著床前胚胎（妊娠第20天）及各器官組織，通過PCR方法檢測YAP19基因表達情況。由圖4可以看出，YAP1基因可表達于牛著床前胚胎及各器官中。

2.4 熒光素酶分析法檢測TEAD家族和YAP1對IFNT基因表達的調節

2.4.1TEAD1和YAP1對IFNT基因表達的調節如圖5所示。

將TEAD1和YAP1質粒與IFNT5′端切除報告基因共轉染入JEG3細胞中，用熒光素酶分析法分析TEAD1和YAP1對IFNT基因的表達調控及其可能的作用位點。

由試驗結果可以看出，在IFNT基因5′端上游區域逐漸切除的情況下，YAP1對IFNT基因的表達都有顯著的上調作用；TEAD1對IFNT基因表達的影響不顯著，但在將IFNT基因5′端上游區域切除到150bp時，TEAD1可使IFNT基因表達顯著升高；TEAD1和YAP1共同作用時，協同效果不顯著。

2.4.2IFNT基因點突變時TEAD1和YAP1對IFNT基因表達的調節。

在IFNT基因點突變的情況下，TEAD1和YAP1對IFNT基因表達的調節如圖6所示。

本試驗中，使用5′端上游區域為631bp的IFNT報告基因，同時，該報告基因進行了不同的點突變：AP1結合位點（－593bp）點突變；CDX2結合位點點突變（－300bp和－293bp）；可能的TEAD結合位點點突變（－470bp）。

由試驗結果可以看出，在－631bp－IFNT報告基因中，YAP1對IFNT基因的表達都有顯著的上調作用，并且這種上調作用不受AP1、CDX2及可能的TEAD結合位點點突變的影響；當TEAD1和YAP1共同作用時，協同效果不顯著。

圖6 IFNT基因點突變時，TEAD1和YAP1對IFNTc1基因表達的調節

3 小結與討論

IFNT基因主要由反芻動物著床前胚胎滋養層細胞表達，目前已發現可結合于IFNT基因5′端啟動子區域，使IFNT表達上調的轉錄因子有ETS2［7］，AP1［8］，CDX2［6，9］，GATA2/3［10］，此外，有研究表明，在哺乳動物發育期間，大多數的胚胎和胚外組織至少表達一種TEAD蛋白［11］。TEAD家族蛋白與轉錄共激活因子YAP（Yes associated protein）結合，參與到Hippo信號通路中，調控細胞接觸性抑制，控制器官體積和癌癥發生［12］。

本研究探討了TEAD1和YAP1對牛IFNT基因的表達調控作用。研究發現，TEAD1對IFNT基因的表達影響不顯著；YAP1對IFNT基因表達具有顯著的上調作用，并且這種上調不受到IFNT基因5′端上游區域切除或已知轉錄因子結合位點點突變的影響，據此推測YAP1對IFNT基因的上調作用很可能不是通過其啟動子區域實現，而是間接實現的。具體研究機制還有待進一步的研究。

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