鵝副黏病毒L基因片段的克隆及其主要抗原表位區的原核表達

馬 輝，邊傳周，趙緒永，鄭寶亮，鄭 鳴

（鄭州牧業工程高等專科學校 生物工程系，河南 鄭州450011）

鵝副黏病毒病是由鵝副黏病毒（GPMV）引起的急性病毒性傳染病，病鵝及其分泌物、排泄物是本病的主要傳染源，主要以消化道病變為特征。成年鵝群流行過程中發病率高達50%～70%，死亡率達10%～20%左右；在15日齡以下的鵝群中可引起100%的死亡，給養鵝業帶來了很大的經濟損失［1］。

1997年，我國王永坤等首次用SPF雞胚從患病鵝群中分離出鵝副黏病毒，此后陸續分離到多株病毒［2］。鵝副黏病毒（GPMV）屬于副黏病毒科，副黏病毒亞科，腮腺炎病毒屬，該病毒與新城疫病毒有部分相同的免疫原型［3］。鵝副黏病毒顆粒大小不一，形態不整，表面有密集纖突結構，病毒內部有囊膜包裹著的螺旋對稱的核衣殼。基因組為單股負鏈線型RNA，約15kb，包括6組基因，主要編碼6種結構蛋白，其中M蛋白、HN蛋白和F蛋白為外膜蛋白，存在于病毒衣殼外，L蛋白、NP蛋白和P蛋白為內部蛋白，存在于衣殼內；另外，在GPMV基因轉錄中P基因還可產生V和W兩種非結構蛋白［4］。

L基因編碼的L蛋白是GMPV所有結構蛋白中分子量最大的一個，含2 204個氨基酸。L蛋白與P蛋白一起構成有活性的病毒轉錄復合物［5－6］。本試驗通過RT－PCR方法擴增了國內分離株SF02的L基因的部分片段，經序列測定驗證，構建了GPMV L基因片段的原核表達載體，并進行了誘導表達和表達蛋白抗原性的檢測，獲得了重組的L基因主要抗原表位區，為進一步研究L蛋白的功能及鵝副黏病毒病的預防和控制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和受體菌 鵝副黏病毒SF02株由鄭州牧業工程高等專科學校中心實驗室保存；pGEM－T，購自 TaKaRa公司；pGEX－6P－1、大腸桿菌 DH5α、BL－21由鄭州牧業工程高等專科學校生物技術實驗室保存。

1.2 主要試劑 dNTP Mixture、限制內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、DNA Ligation Kit Ver.2.0、質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA酶抑制劑、DL－2 000DNA Marker和蛋白質分子量標準等，購自TaKaRa公司；高保真酶KOD－Plus，購自TOYOBO公司；TRIzol試劑盒，購自Invitrogen公司；M－MLV反轉錄酶，購自Promega公司；Glutathione Sepharose 4B親和層析樹脂，購自Pharmacia Biotech公司；兔抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體，購自Sigma公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；序列測定由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，雞抗GPM V血清由本實驗室制備。

1.3 擴增GPMV2L基因片段的引物的設計 參照GPMV SF02［7］株全基因組序列，使用Primer Premier 5.0設計1對引物擴增F基因，引物序列為：

上 游 引 物P1：5′－GAAGGATCCATGGCGGGCTCCGGTCCTGAA－3′（BamHⅠ），下游引物P2：5′－CCGCTCGAGGTTCAGGTTTCCGTAGACTAA－3′（XhoⅠ）。

1.4 鵝副黏病毒的增殖與RNA的提取 種毒經1∶5 000稀釋后，接種于10日齡SPF雞胚絨毛尿囊腔（0.2mL/胚），同時以無菌生理鹽水相同條件接種作為對照，37℃培養，收集24～48h接種病毒的死亡雞胚尿囊液及對照組尿囊液，保存于－70℃備用。用Trizol試劑提取病毒RNA，對照組尿囊液以相同條件及步驟進行處理。

1.5 擴增L基因片段 RT－PCR反應參照 MMLV Reverse Transcriptase RNase H Minus的說明進行，加入設計的引物以合成第一鏈。以cDNA為模板，高保真酶KOD－Plus擴增了L基因片段，PCR反應體系為：PCR Buffer 5μL，dNTPs 5μL，Mg2＋2μL，P1、P2引物各1.5μL，cDNA 模板2 μL，KOD－Plus（1.0U/μL）1μL，加無菌水至總體積為50μL。PCR擴增程序如下：94℃ 變性5min，然后94℃1min，58℃1min，68℃1min，30個循環，72℃ 延伸10min。以瓊脂糖凝膠電泳30min，分析并記錄掃描結果。陰性對照用無菌水代替模板。

1.6 重組表達載體的構建及鑒定 將回收的L基因片段與pGEX－6P－1載體經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后通過T4DNA連接酶連接，采用氯化鈣轉化法，將連接產物轉化入BL－21感受態細胞中，涂布于含Amp的LB平板上，37℃培養過夜。經菌落PCR鑒定和質粒的酶切鑒定，將陽性重組質粒送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

1.7 重組菌的誘導表達 取重組菌接種至含Amp的LB液體培養基中，培養至OD600為0.6時，加入IPTG以不同的終濃度50μmol/L、100μmol/L，不同的誘導時間2h、3h、4h，不同誘導溫度30℃、37℃進行誘導，以 pGEX－6P－1－L不加IPTG 為對照。菌體經超聲波破碎，制備蛋白質電泳樣品，使用SDS－PAGE方法檢測融合蛋白表達情況。

1.8 GST－L融合蛋白的親和純化 將Glutathione Sepharose 4B樹脂填料與菌體超聲破碎后的上清混勻，室溫孵育，填料親和吸附融合蛋白后棄去上清；然后加1倍柱床體積的還原性谷胱甘肽洗脫，使融合蛋白從填料中釋放。SDS－PAGE檢測每次的洗脫產物，并利用Bradford法測定純化蛋白含量［8］。

1.9 Western blot檢測重組蛋白的抗原性 將GST－L融合蛋白進行 Western－blot檢測，以鵝副黏病毒陽性雞血清作為一抗，用兔抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體作為二抗［9］。

2 結果與分析

2.1 GPMV L基因片段的克隆 以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測到561bp左右的片段，與預期目的大小相符（圖1）。

圖1 GPMV L基因片段擴增

2.2 原核表達載體pGEX－6P－1－L的鑒定 用BamHⅠ和XhoⅠ對重組質粒雙酶切，出現預期大小的片段（圖2）。將酶切鑒定后的重組質粒送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序，結果顯示，L基因片段與pGEX－6P－1載體連接正確，說明pGEX－6P－1－L表達載體構建成功。

圖2 pGEX－6P－1－L雙酶切

2.3 重組蛋白的誘導表達和檢測 將帶有重組表達質粒的BL21重組菌培養后，IPTG終濃度50 μmol/L，37℃培養3h誘導條件下，SDS－PAGE顯示在大約47kD處有蛋白表達，與預期大小一致，且在沉淀和上清中都存在，檢測上清中融合蛋白含量為380mg/L。大量誘導表達GST－L融合蛋白，使用Glutathione Sepharose 4B樹脂填料親和純化，得到了較高純度的融合蛋白（圖3）。

圖3 pGEX－6P－L誘導表達產物和純化結果的SDS－PAGE分析

2.4 純化的重組蛋白的Western blot分析 表達產物經SDS－PAGE后，電轉移至硝酸纖維素膜（NC）上，進行 Western blot檢測，在47kD左右可見特異性條帶（圖4），說明pGEX－6P－1－L重組蛋白可與鵝副黏病毒多克隆抗體反應，表明重組蛋白具有較好的抗原性。

圖4 重組質粒pGEX－6P－1－L表達產物的 Western blot檢測

3 討論

隨著基因工程技術的發展，越來越多的載體在原核、真核系統中可以有效進行蛋白表達。原核表達具有操作方便、快捷、需時較短、表達量大、適合工業化生產等優點，pGEX表達系統中GST融合表達蛋白可以增加外源蛋白的可溶性，并且GST標簽利于后續的純化，另外融合蛋白中的GST標簽可以被蛋白酶很方便的切除下來。

目前，鵝副黏病毒具有高度發病率和死亡率，給養鵝業帶來了巨大的經濟損失。鵝一旦發病，目前并無明顯治療效果的藥物。在預防鵝副黏病毒病時主要方法為疫苗免疫，目前使用的弱毒苗存在著毒性返祖的危險，而鵝副黏病毒油乳劑滅活苗免疫時常需同時注射抗鵝副黏病毒血清，且存在免疫期短，免疫時常失敗等情況［10］。

L蛋白是鵝副黏病毒轉錄復合物的主要部分，其中L蛋白N端數個氨基酸參與病毒RNA的轉錄與修復，而且不同于HN和F蛋白，L蛋白這一區段具有高度保守性，具有良好的免疫原性，因此L蛋白可以用作鑒別副黏病毒的診斷抗原［11－12］；另外鵝副黏病毒病在形態學上與其他禽副黏病毒病難以區分，急需建立特異敏感的免疫學診斷方法，因此我們克隆表達了L基因的N端部分，通過SDS－PAGE電泳和Western－blot的結果表明，表達的蛋白質相對分子質量為47kD，與理論值相符；并通過親和純化為制備大量及高純度的GPMV診斷抗原打下了良好的基礎。我們期望通過融合表達鵝副黏病毒抗原區為研制鵝副黏病毒亞單位疫苗和篩選L蛋白特異單抗奠定基礎。

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