巴馬香豬類固醇激素急性調節蛋白（StAR）基因真核表達載體的構建及鑒定

吳 群，魏 泓，肖 榕，卿利娟，葛 亮，李 婧，商海濤，鄭小波，劉 宇

（1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌402460；2.中國人民解放軍第三軍醫大學基礎部實驗動物學教研室，重慶 沙坪壩400038）

類固醇激素合成急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR），也稱類固醇激素靈敏調節蛋白，是促進膽固醇由線粒體外膜轉入到線粒體內膜的一種轉運蛋白，在膽固醇的代謝以及類固醇激素的合成中起關鍵的限速作用［1］。研究表明，StAR不僅存在于類固醇激素生成組織（腎上腺、睪丸、卵巢），而且表達于其他組織中，其中研究最多的是肝臟［2－3］。此外，StAR在調節睪酮的合成過程中起重要的作用，是維持正常生理功能所必須的一種重要蛋白［4］。最近的研究表明，StAR通過調節膽汁酸的合成，增加膽固醇的排泄，為脂肪肝等脂類代謝異常類疾病的防治提供了一條新的途徑［5］。目前，國內外對StAR蛋白的研究主要集中在嚙齒動物，關于豬StAR蛋白的調節功能及其機制的研究較少。

為此，本試驗根據NCBI上發布的豬StAR基因cDNA序列（NM_213755.2），對巴馬香豬StAR基因進行克隆，旨在構建真核表達pEGFP－C1－StAR載體，為進一步探討StAR基因表達產物的生物學活性以及功能提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 豬睪丸組織 取自解放軍第三軍醫大學實驗動物教研室學校豬場，健康巴馬香豬睪丸組織。

1.2 菌株、質粒和試劑 菌株E.coliDH5α、反轉錄試劑盒等，購自TaKaRa公司；RNA快速提取試劑盒，購自北京艾德萊公司；pEGFP－C1載體由本實驗室保存。

1.3 引物設計和合成 根據NCBI上發布的豬StAR基因cDNA序列，交由TaKaRa公司合成，下劃線為酶切位點，引物序列如下所示：

上 游 引 物：5′－GCTAGCTGCCTCCGCTACCAGGAAACA－3′，（含 NheI的酶切位點）；

下 游 引 物：5′－GAATTCGCTGAGCTTTAACACCTGGCTTC－3′，（含EcoRⅠ的酶切位點）。

1.4 StAR基因全長cDNA的獲得 用RNA提取試劑盒從睪丸組織中提取總RNA。RT－PCR擴增總RNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得巴馬香豬的StAR基因?；厥漳康钠巍?/p>

1.5 StAR基因克隆載體的構建 目的片段接連至pSURE－T克隆載體的反應液于16℃連接過夜。轉化入E.coliDH5α，進行藍白斑篩選，擴大培養白色菌落。對菌液雙酶切初步鑒定后，挑選陽性克隆菌液送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.6 pEGFP－C1－StAR真核表達載體的構建 將克隆陽性質粒和pEGFP－C1載體質粒經NheⅠ和EcoRⅠ進行大體系雙酶切?；厥漳康幕蛐蛄泻途€性化的載體序列，在T4連接酶作用于16℃連接過夜，轉化后挑取陽性菌落，經酶切鑒定和測序，所得重組克隆載體命名為pEGFP－C1－StAR。

2 結果

2.1 StAR基因的RT－PCR擴增 以巴馬香豬的總RNA為模板進行RT－PCR擴增，在858bp處出現1條明顯的條帶，它與預期估計值較為接近（圖1－A）。

2.2 克隆質粒pSURE－StAR質粒PCR鑒定 將純化后的StAR的PCR產物與pSURE－T載體連接，轉化到E.coliDH5α受體菌，獲得的重組質粒經PCR擴增后出現目的片段（圖1－B）。

2.3 pEGFP－C1－StAR 重組質粒的 PCR 檢測與酶切鑒定 以pEGFP－C1－StAR重組質粒為模板，進行PCR擴增，觀察到1條長度在750～1 000bp的特異性條帶（圖1－C）。pEGFP－C1－StAR 重組質粒用NheⅠ和EcoRⅠ進行酶切鑒定，可以看到目的條帶清晰且片段大小正確（圖1－D）。

圖1 StAR基因載體構建與鑒定

2.4 測序結果 如下引物圖為巴馬香豬StAR基因序列。

2.5 StAR基因ORF序列同源性分析和堿基差異比較 對測序所得的StAR基因序列與GenBank中發表的3個StAR蛋白序列進行同源性比較（圖2）和堿基差異比較（表1）。結果表明，巴馬香豬StAR基因ORF序列與其他參考序列的同源性高達99.3%～99.8%。

圖2 豬StAR基因ORF序列同源性分析

表1 豬StAR基因堿基差異比較

2.6 同源性進化樹分析 利用DNA Star軟件構建分子進化樹（圖3），從進化樹中可以看出巴馬香豬單獨成枝，不存在與其他豬種相互滲透，與其他枝葉的進化距離較遠。

3 討論

巴馬香豬是我國特有的小型豬品系資源，其在解剖結構、生理代謝等方面與人體具備高度相似性，且豬遺傳修飾相對容易，建立豬的基因工程模型已成為當今世界生物醫藥研究的熱潮。因此，巴馬香豬作為一種地方純種豬，將是研究疾病模型的重要選擇。

圖3 豬StAR cDNA序列的分子進化樹

研究表明，許多疾病與StAR基因存在密切的關系。例如，先天性脂樣腎功能增生綜合征（CLAH）是StAR蛋白基因突變所引起的常染色體隱性遺傳性疾?。?］。此外，在多囊卵巢綜合征（PCOS）中，StAR 蛋白在內膜細胞和顆粒細胞中過度表達，造成顆粒細胞不成熟黃體化［7］。Ning等［5］的研究表明，StAR表達與年齡及血脂有一定的聯系，為進一步探討脂質代謝紊亂在動脈粥樣硬化中的作用奠定了基礎。另外，StAR基因是類固醇激素合成的關鍵性調節因子，在睪丸激素調控方面起著重要的作用。

StAR在不同物種間一致性為85%～90%，相似性大于90%［8］。本試驗從巴馬香豬擴增得到了StAR基因ORF區序列，全長858bp，編碼285個氨基酸，序列分析表明，擴增的豬StAR基因ORF區序列與GenBank中3個豬StAR基因mRNA序列（登錄號為 AB530157.1、AY368628.1、AY800265.1）的同源性為99.3%～99.8%。StAR的氨基端（N′－端）由62個氨基酸組成的線粒體引導序列；羧基端（C′端）為生物活性部位，可與脂質或膽固醇結合，大約由210個氨基酸組成，該結構域稱為StAR相關脂質轉運結構域（START）［9］。缺失 C－末端第28氨基酸會致使StAR失去活性［10］。經文獻分析表明，構建的StAR序列第26位氨基酸與其他豬種存在差異。

構建真核表達載體是研究蛋白功能的一種重要工具。本試驗成功擴增和克隆了豬StAR基因，并構建了豬StAR的真核表達載體pEGFP－C1－StAR，為下一步StAR基因在豬睪丸間質細胞中的特異性表達做準備。

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