豬圓環病毒2型去除NLS的cap蛋白基因的克隆與B細胞抗原表位的預測

苗麗娟，張立春，唐艷林

（吉林農業科技學院動物醫學學院，吉林 吉林132101）

豬圓環病毒2型（PCV2）是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）等相關疾病的主要病原。該病1991年在加拿大首次報道［2］，主要感染5～12周齡仔豬，致死率可達40%，PCV2在淋巴細胞增殖，可引起免疫細胞的凋亡，損傷豬體的免疫系統造成免疫抑制，易造成PPV、PRRS及其他疾病的繼發感染，給全世界養豬業帶來巨大的經濟損失。

PCV2是圓環病毒科（Circoviridae）圓環病毒屬成員，為單股環狀負鏈無囊膜的DNA病毒，為已知的最小動物病毒之一，約17～20nm，二十面體對稱。根據病毒的抗原性和基因組成不同，可分為2種基因型或稱血清型，即PCV1型和PCV2型。PCV1型無致病性；PCV2型具有致病性，基因組全長1 767bp或1 768bp，包括11個讀碼框，其中ORF2編碼病毒的主要結構蛋白－核衣殼蛋白（Cap），決定著PCV2的表型特異性，現在的基因工程疫苗是疫苗研究的熱點，技術思路是通過分析病毒的基因序列來預測病原體的抗原信息，然后篩選出合適的候選抗原，進而研制出有效的疫苗，本文的目的就是在已獲得的PCV－2基因組序列資料的基礎上，運用計算機和分子生物學軟件對其結構蛋白的二級結構和B細胞抗原表位進行預測，從而為PCV－2的反向疫苗學研究提供理論依據；為研制適合臨床應用的ELISA診斷試劑盒和單克隆抗體的制備和抗原表位的鑒定工作奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 pcv－581重組質粒的構建

1.1.1 PCR擴增去除 NLS基因的pcv－581

1.1.1.1 引物的設計與合成 根據本實驗室保存毒株的測序結果，用Oligo 6.0設計刪除核定位信號特異引物（由寶生物工程（大連）有限公司合成），并引入限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ（加下劃線表示）。上游引物：ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC；下游引物：GAAAGCTTTTCATTAAGGGTTAAGT；產物長度581bp。

1.1.1.2 PCV2核酸的提取 取接種PCV2病毒的PK－15細胞懸液500μL，常規方法提取，最后加20μL滅菌去離子水溶解，－20℃保存。

1.1.1.3 PCR擴增 PCR的反應體系總體積25 μL：上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，10×RCR Buffer 2.5μL、dNTP 3.0μL（2.5mmol/L each），提取的 DNA 2.0μL，Taq酶0.25μL（5U/μL，TaKaRa），去離子水補到25μL。反應參數為：95℃，5min；94℃，45s；55.9℃，45s；72℃，45s；30個循環；72℃，7min。取5μL PCR產物進行電泳分析（結果見圖1）。

1.1.1.4 PCR 擴增產物的酶切、回收 醇沉淀PCR擴增產物、酶切、回收。具體操作方法如下：PCR產物補到100μL，加入等體積異丙醇，置－20℃靜止過夜，13 000r/min離心15min棄上清，加入600μL 75%乙醇，7 000r/min離心5min，倒掉上清，晾干，加入10μL滅菌去離子水溶解。將醇沉產物進行BamHⅠ酶切，體系為20μL：10×Buffer K 2μL，BamHⅠ1μL（15U/μL ，TaKa－Ra），醇沉淀產物10μL，H2O 7μL，37℃酶切1h。將酶切產物繼續醇沉淀（方法步驟同上）后進行HindⅢ（15U/μL，TaKaRa）單酶切，酶切體系同上，回收目的片段。

1.1.2 pQE－pcv581重組質粒的構建和鑒定 將載體pQE－32（QIAGEN）質粒用BamHⅠ 和HindⅢ雙酶切，做100μL酶切體系：10×Buffer K 10μL，BamHⅠ2μL，HindⅢ2μL，pQE－32質粒 70 μL，H2O 16μL。37℃酶切2h15min，用膠回收試劑盒回收（TIANGEN，操作按照說明書進行），目的片段和載體常規方法連接、轉化M15、篩選陽性重組質粒pQE－pcv581。酶切鑒定（見圖2）。

1.2 PCV－2結構蛋白二級結構的預測 運用Camier－Robson方法（Camier）、Chou－Fasman方法和 Karplus－Schulz方 法 預 測 PCV－2 去 除 NLS ORF2結構蛋白的二級結構。

1.3 PCV－2結構蛋白B細胞抗原表位的預測 用Kyte－Doolittle方法對結構蛋白的疏水性進行了分析，用Emini方法預測各結構蛋白的表面可能性，以Jameson－Wolf方法預測結構蛋白的抗原指數，然后綜合評價PCV－2去除NLS ORF2結構蛋白B細胞抗原表位的地位。

2 結果

2.1 pcv－581重組質粒的構建

2.1.1 PCR擴增去除 NLS基因的pcv－581 取5 μLPCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，與標準分子量DL－2 000標準帶型比較，特異條帶分子量位于0.5kb和0.75kb之間，約581bp，符合理論值，以水為對照未擴增出任何條帶（見圖1）。結果表明，已得到特異性的pcv－581片段。

圖1 pcv－581PCR擴增1：Negitive control；2：The PCR product of pcv－581；M：DNA Marker DL－2 000

2.1.2 pQE－pcv581重組質粒的構建和鑒定 重組質粒進行雙酶切鑒定，將此酶切回收產物5μL上樣，用0.9%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Marker 19000和Marker DL－2 000同時比較，獲得符合預期的目的基因條帶，表明成功構建了重組質粒。

圖2 重組質粒的雙酶切鑒定M1：λ－EcoT14Idigest 19329；1：pQE－pcv581digested with BamHⅠand HindⅢ；M2：DNA Marker DL－2 000

2.3 PCV－2結構蛋白二級結構的預測 Camier－Robson方法是通過計算機特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性來預測蛋白質的二級結構的。用該方法預測PCV－2去除NLS ORF2結構蛋白二級結構，發現它沒有α螺旋形成，但有許多β折疊存在，且分布比較均勻，在各β折疊單元存在長短不一的轉角。該方法預測的結果顯示，在該蛋白的跨膜區有一些小α螺旋結構形成（見中插彩版圖3）。

Chou－Fasman方法是通過序列氨基酸的殘基的晶體結構來預測二級結構，用該方法預測的PCV－2結構蛋白二級，發現它有少量α螺旋結構形成，其位置分別在第27～33位、56～65位、89～96位、142～148位、178～186位、191～195位區段。相應的，用該方法預測的β折疊和轉角的結構就較少并主要在該蛋白的兩端（見中插彩版圖3）。

2.4 PCV－2結構蛋白親水性分析用 Kyte－Doolittle方法對PCV－2去除NLS ORF2結構蛋白的親水性進行了分析。結果顯示，該蛋白存在眾多的疏水性區域，而且親水性指數比較高，其中包括第3～77位、98～193位氨基酸殘基，提示該區域暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也最大（見中插彩版圖4）。

2.5 PCV－2結構蛋白的表面可能性分析 見中插彩版圖5，PCV－2結構蛋白的氨基酸呈現在表面可能性較大的區域主要是第7～25位、第44～60位、第96～122位、第133～140位、第164～170位區段，其他部位展示的可能性較小或表現為負值。

2.6 PCV－2結構蛋白骨架區的柔韌性分析 PCV－2結構蛋白骨架區含有較多的柔韌性區域，且分布比較均勻，提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發生扭曲、折疊的幾率較高，能形成豐富的二級結構（見中插彩版圖6）。

2.7 PCV－2結構蛋白B細胞抗原表位的預測分析 通過聯合以上蛋白質結構預測方法分析PCV－2結構蛋白潛在的蛋白抗原決定簇，結果顯示結構蛋白含有許多抗原指數較高的區域，提示該區段含有潛在優勢抗原表位，如第7～25位區段，第40～88位區段，第102～154位區段、164～173位區段等（見中插彩版圖7）。這些區域的抗原指數也比較高，但是親水性和表面呈現指數偏低，因此要綜合性看待其作為抗原表位的可能性。

3 討論

3.1 本試驗主要是對去除NLS ORF2的基因進行克隆，由于ORF2的特性使其成為在分子水平上特異性檢測PCV2的理想抗原。由于目前仍然無有效的措施防治豬圓環病毒病，因此對PCV診斷尤為重要。

3.2 本試驗借助于計算機技術和生物學軟件對 PCV2結構蛋白的二級結構和潛在的B淋巴細胞抗原表位進行了預測和分析，分析結果表明，該蛋白形成主要是用為研制一種適于臨床應用的、簡便、快速的ELISA診斷試劑盒和單克隆抗體的制備奠定了技術基礎。

［1］ 符芳，王曉武，李曦.一株2型豬圓環病毒的分離及其序列、致病性的初步分析［J］.黑龍江畜牧獸醫，2007，8（3）：78－80.

［2］ Clavk E G.Postweaning mutisystanic wasting syndrome［A］.Proceedings of the American Association of Swine P racticiances［C］.1997：499－501.