半套式RT－PCR檢測動物狂犬病病毒的研究

袁穎爍，趙敬慧，宋菲菲，劉 曄，張守峰，張樂萃，扈榮良

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所 吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122）

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（RV）感染引起的高致死性人獸共患傳染病，人和所有溫血動物對狂犬病病毒都易感，一旦發病，死亡率幾乎為100%，嚴重威脅人畜的健康。我國是受狂犬病危害最為嚴重的國家之一。不同毒株的狂犬病病毒N蛋白基因序列具有較高的保守性、同源性和高拷貝復制的特點，因此可用于狂犬病的分型、診斷、流行病學分析調查研究等。

目前可以通過檢測組織中的病毒、病毒蛋白（抗原）或基因組RNA（核酸），比較肯定地對狂犬病作出診斷。具體方法包括：電鏡直接觀察病毒顆粒狀態、病毒的體內或體外分離培養、通過標記的熒光抗體或間接染色的方法檢測病毒蛋白、反轉錄－聚合酶反應檢測病毒的RNA等。另外，狂犬病病毒感染的間接證據，可通過檢測未免疫血清中的病毒中和性抗體或腦脊髓液中存在的抗體確定［1－2］。其中，RT－PCR方法不僅可以檢測細胞培養的RV，還可以直接用于臨床樣品的檢測，已廣泛應用于狂犬病的實驗室診斷和流行病學調查，具有很好的應用前景。本研究針對我國狂犬病病毒均屬基因1型，且易感動物種類多、流行毒株可能存在多樣性分布的特點，以N基因保守區為靶序列設計了兩對引物，建立了一種特異性好、靈敏度高、簡便快速的半套式RT－PCR方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Trizol Reagent RNA提取試劑盒（Invitrogen）；One Step RNA PCR Kit（AMV）（TaKaRa），EX－Taq酶等試劑，均購自寶生物工程（大連）有限公司；FITC標記的狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體，由軍事獸醫研究所流行病學研究室制備。

1.2 主要耗材和儀器 TGRANDIENT PCR儀，購自 HYBAID公司；PCR管，購自AXYGEN公司；VI Firereader XS凝膠成像系統，購自華粵行公司；DYFⅢ2型電泳儀，購自Bio－Rad公司。

1.3 毒株、乳鼠及病料 CVS－11、SRV9、ERA、Flury－LEP細胞毒、CVS－24腦毒以及23株RABV野外分離株（＊）均為本實驗室保存，其他臨床病料信息見表2；新生ICR乳鼠（清潔級），由吉林大學醫學部實驗動物中心提供。

1.4 半套式RT－PCR檢測方法的建立

1.4.1 引物設計與合成 參考GenBank公布的RV N基因全序列進行同源性比較分析，選取序列中保守的區域，根據RT－PCR引物設計原則，利用Primer5.0軟件設計了2對半套式RT－PCR引物。（引物信息見表1）外套引物（NF/NR1）擴增片段長874bp，內套引物（NF/NR2）擴增片段長508bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，使用時用DEPC水稀釋至10μmol/L。

表1 引物序列

1.4.2 細胞毒和臨床病料總RNA的提取 參考Trizol Reagent RNA提取試劑盒說明書操作。

1.4.3 一步法RT反應及外套RT－PCR反應 參照One Step RNA PCR Kit（AMV）的說明書進行，將提取好的總RNA沉淀中加入23μL的Rnase Free H2O使之溶解后，直接加入如下體系的PCR管中：10×One Step RNA PCR Buffer 5.0μL，MgCl2（25mmol/L）10μL，dNTP Mixture（各 10 mmol/L）5.0μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV－OptimizedTaq（5U/μL）1μL，上游引物 NF（10μmol/L）2 μL，下游引物 NR1（10μμmol/L）2μL，總體積50 μL。經50℃水浴30min后，直接進行外套PCR反應，也可立即放置－70℃保存備用。外套PCR循環步驟為：94℃，3min→（94℃，30s→59℃，30s→72℃，40s）30個循環→72℃，8min延伸。

1.4.4 半套式 RT－PCR 取2μL PCR外套擴增產物為模板，建立50μL內套PCR反應體系如下：PremixTaq25μL，上游引物NF（10μmol/L）2μL，下游引物 NR2（10μmol/L）2μL，2ddH2O 19μL。內套PCR循環步驟為：94℃，3min→（94℃，30s→64℃，30s→72℃，30s），30個循環→72℃，7min延伸。

1.5 靈敏度試驗 將SRV9弱毒株細胞培養物（約10－4.25TCID50/mL）用0.01mol/L 1×PBS（pH 值7.4）進行1×10－1～1×10－1010倍系列稀釋，分別取200μL按照上述方法提取總RNA后進行PCR檢測。

1.6 特異性試驗

1.6.1 非狂犬病病毒的檢測 采用上述方法對犬瘟熱病毒（CDV）、犬細小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、偽狂犬病病毒（PRV）等幾種非狂犬病病毒進行RNA或DNA提取，首先用病毒提供者建議的RT－PCR或PCR方法對各病毒進行鑒定，，并設陰性對照，鑒定成功后再進行半套式RT－PCR檢測，以驗證該方法的特異性。其中，CPV、CAV、PRV為DNA病毒，可直接進行半套式RT－PCR，CDV為RNA病毒，檢測步驟與RV完全相同。

1.6.2 不同動物腦組織的檢測 用該方法對犬、鼬獾（江西）、黃鼠狼等3種不同易感的腦組織樣品進行檢測，并與FAT試驗相比較，以確定所建立方法對狂犬病病毒易感動物檢測的特異性（樣品信息見表2）。

表2 檢測用不同動物腦組織的背景信息及試驗

1.7 敏感性試驗 分別對 CVS－11、SRV9、ERA、Flury－LEP、CVS－24和本實驗室保存的23株野外分離株腦毒進行半套式RT－PCR和FAT同步檢測，驗證引物的敏感性及兩者符合情況。

2 結果

2.1 半套式RT－PCR擴增結果 在優化了PCR條件的基礎上，本研究建立了一種以N基因為靶序列的半套式RT－PCR方法。結果顯示，陽性樣品可擴增出特異性目的片段，且背景清晰，無拖帶現象，而陰性對照無特異條帶。

2.2 靈敏度試驗 經外套擴增可見到大小為874 bp的特異性目的片段；經內套擴增后，1×10－3倍稀釋的細胞毒也可見到508bp的特異擴增產物，即對SRV9細胞毒的檢測靈敏度可達到0.01個TCID50/mL（圖1）。

2.3 特異性試驗

2.3.1 非狂犬病病毒的檢測 針對犬瘟熱病毒（CDV）、犬細小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、偽狂犬病病毒（PRV）等非狂犬病病毒的RT－PCR或者PCR方法檢測均擴增出陽性目的片段，陰性對照成立，而用上述方法病毒樣品均未表現陽性結果。

2.3.2 不同動物腦組織的檢測 對犬、鼬獾、黃鼠狼等樣品進行檢測，結果均有特異性目的條帶出現。24例免疫熒光抗體試驗（FAT）確定為陽性的樣品，在半套式RT－PCR中均為陽性；FAT為陰性的樣品，在半套式RT－PCR中2例為擴增陽性，將樣品進行小鼠腦內接種試驗（MIT），取死亡小鼠腦做FAT試驗，結果呈陰性；將腦組織樣品在37℃放置72h后，用半套式RT－PCR法仍可檢測到陽性結果。新鮮樣品檢測為陰性的樣品，以同樣條件放置后仍為擴增陰性（見圖2、表2）。

圖1 半套式RT－PCR檢測SRV9細胞培養物的電泳圖

圖2 半套式RT－PCR檢測RV易感動物腦組織的電泳

2.4 敏感性試驗 分別對 CVS－11、SRV9、ERA、Flury－LEP細胞毒和CVS－24腦毒及本實驗室保存的23株野外分離株腦毒進行半套式RT－PCR檢測及腦毒FAT同步檢測，均獲得陽性結果，敏感性較高。

3 討論

本試驗針對基因Ⅰ型狂犬病毒（RV）并偏顧于我國固定毒株和流行性毒株，設計2對引物，建立了一種特異檢測RV的半套式RT－PCR方法，該方法不僅可以檢測細胞培養的RV，還可以直接用于臨床樣品的檢測。世界衛生組織推薦FAT為診斷人和動物狂犬病快速而敏感的金標方法［3］，但該方法也有其局限性。例如，它需要熒光顯微鏡的支持且耗時較長［4］，并且結果受抗體質量的影響很大，病毒細胞培養則存在病變是否產生的問題［5］，另外，它對樣本的新鮮度有一定要求，在腐敗樣品的檢測中敏感度下降，易出現假陰性，且在暗環境中進行大量樣品檢測時，工作人員易產生視覺疲勞，從而造成誤判、漏判。本試驗所建立的半套式RT－PCR方法特異性和敏感性均較高，檢測結果直觀，更適合大量樣品的檢測工作，且基本克服了FAT對腐敗樣品檢測的問題。值得一提的是，考慮到多樣品檢測時半套式RT－PCR可能存在的漏檢和交叉污染現象，本研究采用一步法RT－PCR，反轉錄和PCR均在同一管中進行熱循環，無需打開管蓋，操作簡便快速，避免了批量樣品檢測時存在的的交叉污染問題［6］。本研究設計的引物擴增片段含蓋了不同毒株間N基因變異最大區域［7］，有助于狂犬病的分子生物學診斷和流行病學調查分析。本研究對36份腦組織樣品分別進行了檢測，共檢出23份陽性腦組織，與FAT檢測結果完全一致。該方法能從腐敗樣品中檢出病毒RNA，更適用于腐敗樣品的檢測，條件優化后，RNA提取到獲得結果僅用5h即可完成狂犬病的檢測，可用于我國狂犬病臨床樣品的定性檢測和大規模流行病學調查研究，為控制狂犬病工作提供有力的技術保障。

［1］ Meslin F X，Kaplan M M，Koprowski H，eds.Laboratory techniquesinrabies4thed Geneva World Health Organization，1996.

［2］ 扈榮良.狂犬病理論、技術與防治［M］.北京：科學出版社，2007：92.

［3］ WHO Expert Committee on Rabies Ninth report Geneva World Health Organization［J］.2004（WHO Technical Report Series，No.931）.

［4］ Woldehiwet Z.Clinicallaboratoryadvancesinthedetectionof rabiesvirus［J］.Clin Chim Acta，2005，351（1－2）：49－63.

［5］ Poschl B.Waneesorn J，Thekisoe O，etal.Comparative diagnosis of malaria infections by microscopy，nested PCR，and LAMP in northern Thailand［J］.Am J Trop Med Hyg，2010，83（1）：56－60.

［6］ Gupta P K，Singh R K，Sharma R N，etal.Preliminary report on a single－tube non－interrupted reverse transcription－polymerase chain reaction for the detection of rabies virus in brain tissue［J］.Veterinary ResearchCommunications，2001，25（3）：239－247.

［7］ Kissi B，Tordot N，Bourhy.Genetic polymorphism in the Rabies virus nucleoprotein gene ［J］.Virology，1995，209：526－537.