空腸彎曲桿菌臨床株生物膜模型的建立及影響因素的研究

秦曉慶，趙樹臣，侯振中

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030）

空腸彎曲桿菌（C.jejuni）是一種在世界范圍內受到廣泛重視的人畜共患病的病原（Tauxe，1992），該菌生長條件苛刻，使得在分離和實驗室維持培養的過程具有一定的難度。而關于該菌雖具極敏感的特性，卻依然能在環境中存活并致病的原因，目前仍使人困惑。近年來，有研究發現C.jejuni能夠形成一種被稱之為“生物膜”的聚集體［1－2］。細菌生物膜是一種特殊的菌體生存和生長的方式，它能夠保護菌體細胞免受不良環境的傷害，如紫外線、吞噬以及干燥［3］。

本試驗從建立該菌的體外生物膜模型入手，采用結晶紫染色以及光鏡和掃描電鏡的方法對其進行鑒定，用正交法對3種環境因素對該菌生物膜形成的影響進行研究，希望掌握其規律及特性，為該菌生物膜形成的阻斷和消除提供有價值的信息。

1 試驗材料

1.1 試驗菌落C.jejuni臨床分離株，分離菌株的病料采集于哈爾濱市某屠宰場。

1.2 培養基試劑及儀器 改良的Camp－BAP分離培養基、布氏增菌肉湯；PCR Master Mix、DNA Marker、Taq酶、電泳用瓊脂糖、EB；結晶紫染液，乙醇，戊二醛，四氧化鋨，乙酸異戊酯等；超凈工作臺、厭氧培養罐、電熱恒溫培養箱、水套二氧化碳培養箱、紫外可見分光光度計、倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡等。

2 試驗方法

2.1 細菌的分離與鑒定

2.1.1 細菌的分離 將樣本劃線接種于改良的Camp－BAP培養基上，接種后的平板微需氧條件、42℃恒溫培養箱中培養48h～72h［4］。分離到的細菌經過2～3次選擇培養基純化。

2.1.2 病原菌的鑒定 挑取疑似菌落涂片并進行革蘭染色，置于顯微鏡下進行形態學觀察。初步確定為空腸彎曲桿菌后，對其進行相應的生化鑒定和PCR鑒定。

常規生化檢測，參照國家標準SN0175－92以及GB/T 4789.28－2003判定；PCR檢測的具體方法均參考朱建國等［5］所建立的用于C.jejuni的快速PCR鑒定的方法，該方法對C.jejuni可以特異的擴增出516bp條帶，上述流程中所涉及的引物合成及電泳產物的測序等均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

2.2C.jejuni生物膜體外模型建立及鑒定

2.2.1C.jejuni生物膜形成能力的分析 布氏肉湯增菌，微需氧，42℃培養48h～72h，得到C.jejuni濃菌液，無菌布氏肉湯調整菌液濃度至OD600＝0.2。取上述菌液5mL接種于含20mL無菌布氏肉湯的錐形瓶中。將聚苯乙烯片（2×2cm）作為生物膜載體放置到錐形瓶中［6］。

設試驗組和空白對照組（即不接種菌液），42℃厭氧靜置培養5d，每隔1d取出3個樣本，肉眼觀察是否有膜樣物質附著，結晶紫染色后置于電鏡和掃描電鏡下觀察。

2.2.2C.jejuni生物膜模型的鑒定 樣本經1%結晶紫染色后需經過光學顯微鏡（×400）以及掃描電鏡（SEM）鑒別是否建模成功。其中，掃描電鏡樣本處理步驟如下所示［7］：

（1）25mL/L的戊二醛溶液于4℃固定24h，PBS沖洗；（2）1mL/L的四氧化鋨溶液4℃固定4 h，PBS沖洗；（3）300、500、700、800、900mL/L 和100mL/L乙醇梯度脫水；（4）乙酸異戊酯置換，臨界點干燥儀內干燥4h；（5）真空噴金；（6）掃描電鏡觀察并拍照。

2.3 正交法檢測環境因素對C.jejuni生物膜形成的影響 增菌并調整濃度為OD600＝0.2±0.01。按照L9（34）設計正交試驗，正交試驗因素及水平見表1。

表1 正交實驗因素及水平

C.jejuni生物膜形成的水平采用結晶紫法進行檢測，步驟如下［8］：（1）試管法培養C.jejuni生物膜5d；（2）無菌PBS沖洗3次；（3）3%戊二醛固定20min后，37℃烘干；（4）1%結晶紫染色30min，棄去染液，去離子水沖洗，干燥；（5）20%丙酮－乙醇溶液溶解。紫外分光光度計測OD600值，取均值。

3 試驗結果

3.1 菌株的分離及鑒定 劃線培養后得到疑似C.jejuni的菌落，菌落扁平、灰色不閃光、半透明、白色、棕黃色凸起、邊緣不整齊、有時沿接種線擴散。革蘭染色陰性，光學顯微鏡下呈現出與C.jejuni相吻合的形態學特征，例如小逗點狀，或者兩菌體相連呈現出S形、海鷗形或螺旋狀。

對菌株進行常規的生化鑒定和PCR鑒定，結果12個樣本中分離的菌株有6株與C.jejun的生化特性相符，進一步進行PCR鑒定的結果為：生化鑒定的6株C.jejuni陽性菌中有2株得到了特異性片段，該片段長度為516bp［5］。PCR產物測序進一步證實了該2株菌為C.jejuni。

3.2C.jejuni生物膜體外模型的建立結果 經過5d的靜置培養，可見該菌能在載體上形成肉眼可見的膜狀物，而空白對照組的載體上則沒有膜狀附著，初步斷定該菌具有生成生物膜的能力。

染色后，將載體置于油鏡下（×400）可以觀察到從菌體聚集到逐步形成片狀，最后形成膜狀覆蓋在載體上的過程，初步斷定建模成功（見中插彩版圖1）。掃描電鏡觀察，可以從更微觀的層次觀察到菌體相互間連接、粘附、聚集直至形成團狀或是片狀的過程，見圖2。

3.3 環境因素對C.jejuni生物膜形成的影響 環境因素對C.jejuni生物膜形成的影響，通過正交試驗后結果如表2所示。從表2中可以看出，3種因素中，對該菌生物膜形成影響從大到小依次是空氣條件、溫度、培養基（RA＞RC＞RB）。而同一因素處于不同水平時，生物膜的形成也有所差異，綜上，可得出C.jejuni生物膜形成的最佳條件為A2，B1，C3，即在常規的空氣條件下，37℃，MHB培養基，該菌的生物膜形成最為理想。

4 討論

生物膜的形成是細菌對抗抗生素和機體免疫系統的一種手段，也是感染由急性轉為慢性或持續性感染的原因之一［9］。C.jejuni是一種世界范圍內普遍存在的人畜共患病的病原，對各種動物均可感染，豬感染本病的主要癥狀為腹瀉，因此本試驗選取有腹瀉癥狀的豬作為采樣對象，具有一定的現實意義和可行性。對于環境因素對該菌生物膜的影響方面，Reuter［3］和 Reeser［2］曾提出有氧的環境更容易促進C.jejun生物膜的形成，而 Fields［11］、Mclennan［12］也分別報道了營養豐富并不利于該菌生物膜的形成，上述結論都在本試驗中得到了驗證。分析C.jejuni臨床株形成生物膜的能力，觀察生物膜從粘附到成熟的過程并研究其影響因素，對于進一步研究對生物膜形成的阻斷或清除，進而用于對該菌耐藥性的消除具有重要的意義。

圖2 掃描電鏡觀察生物膜形成的過程 （a→b→c）

表2 正交試驗

然而，生物膜形成的機制非常復雜，體外模型的建立只能作為生物膜形成的簡單模擬，要想進一步了解該病原菌生物膜的形成機制以及其在細菌耐藥性方面的作用原理上還需要更大量的研究。

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［10］陽成波，蔣原.空腸彎曲桿菌感染流行病學研究進展［J］.動物醫學進展，2002，23（6）：10－13.

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