華南地區豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及其S基因抗原表位片段的遺傳變異分析

田 野，蘇丹萍，蔣 偉，鐘 望，張顯浩，陳瑞愛，，賀東生，

（1.華南農業大學獸醫學院 廣東省人畜共患病重點實驗室，廣東 廣州510642；2.廣東大華農動物保健品股份有限公司，廣東 新興527400）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病［1］。在1971年比利時和英國，該病毒被首次報道，之后在很多養豬國家都暴發了該病，特別是歐洲和亞洲。我國從1976年開始陸續有PED的報道，20世紀80年代后該病在中國流行面逐漸擴大，并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染，給養豬業造成嚴重經濟損失［3］。

PEDV主要的結構蛋白包括：纖突蛋白（S，180～220kD）、膜蛋白（M，27～32kD）、核衣殼蛋白（N，55～58kD）和小包膜蛋白（E，8.8kD）。其中PEDV的S基因長為4 150bp，由其編碼的S蛋白位于病毒粒子表面，在病毒粒子與細胞表面受體結合后通過膜融合侵入宿主細胞和在感染宿主體內介導中和抗體產生的過程中都發揮重要生物學作用［4－5］。PEDV 的主要中和抗原存在于 S 基因的1 495～1 914bp之間［6］。本次試驗研究分離鑒定華南地區PEDV流行毒株并對其S基因變異進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病料、試劑盒載體 2012年2月份，從華南地區某大型豬場采集疑似豬流行性腹瀉病料，即小腸和肛拭子。MLV、RRI、dNTPs、rTaq，購自廣州瑞真生物技術有限公司；UNIQ－5柱離心式膠回收試劑盒，購自廣州助力生物科技有限公司。

1.2 引物的設計與合成 根據本實驗室己建立的PEDV檢測體系，合成1對針對PEDV M基因的特異性引物，Pm1：5′－TGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTG－3′，Pm2：5′－CCTGTCGGCCCATCACAGAAGTAGT－3′，用于檢測PEDV。根據GenBank上登錄的CV777序列設計了1對針對S基因抗原表位（1 495～1 914bp）的引物，Ps1：5′－GAACTCCATTAGCGTATT－3′，Ps2：5′－CTGCAGATGTACAGACATCTA－3′，來擴增目的片段。以上引物是采用PrimerSelect 5.0軟件設計，由Invitrogen上海生物技術有限公司合成。

1.3 組織病料PEDV的RT－PCR檢測 將研磨好的組織懸液放入1.5mL離心管中，反復凍融3次，5 000r/min離心3min。用Trizol法抽提組織總RNA。根據MLV的說明，取1μL RNA進行反轉錄，之后產生的cDNA進行PCR檢測。

1.4 病毒分離 將陽性病料上清液反復凍融3次，接種到Vero細胞，37℃吸附90min。棄掉毒液后加入含終濃度45μg/mL胰蛋白酶的DMEM（不含血清），培養96h，收毒。用同樣的方法，已傳到第20代。

1.5 PEDV S基因抗原表位序列的克隆與測序以病毒培養液的RNA為模板進行RT－PCR擴增。用UNIQ－5柱進行PCR產物割膠回收，純化的PCR產物與pMD18－T載體連接，轉化至E.coliDH5α感受態細胞。重組質粒經PCR和酶切鑒定后，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司對陽性質粒核苷酸進行測序。

1.6 序列分析 利用Clustalx軟件將測序結果與國內外其他地區的PEDV毒株的相同位置進行多重比對，并用軟件 Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA，version 4.0）進行遺傳進化分析。同時用DNAStar中的MegAlign分析S基因抗原位點氨基酸變化。

2 結果與分析

2.1 PEDV S抗原表位基因克隆、序列測定 應用引物Ps1/Ps2，克隆PEDV S主要抗原表位基因，測序。通過軟件分析該段基因與國內外其他毒株的核苷酸同源性，發現華南地區其他毒株如CH/GD－01/2011、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011等位于同一亞群，而與CV777、Chinju99、SM98、Br1/87等毒株的同源性較低（如圖2），處于不同的亞群。

2.2 病毒分離 病毒在接種Vero細胞前，先與含終濃度55μg/mL胰蛋白酶的DMEM作用5～10 min，然后接種到Vero細胞上，加入含終濃度45 μg/mL胰蛋白酶的DMEM維持液，96h后收取病毒液。在前5代細胞病變不明顯，隨著代數的增多細胞病變逐漸典型。連續傳代至第20代，且傳代后PCR可以檢測到病毒（如圖1）。在15代左右很明顯的觀察到合胞體樣的細胞病變，而且出現細胞病變的時間也從96h減少到72h。

圖1 病毒傳代后PCR檢測圖

2.3 PEDV S抗原表位基因序列的進化分析 利用GenBank上登錄的世界各地不同分支的PEDV 55株作為參考，分析S基因抗原位點堿基的變化。其中發現16個堿基的變化（1509C→T，1545G→T，1575C→T，1642A→G，1677T→G，1688G→A，1695T→C，1710C→T，1761A→T，1777G→A，1782T→C，1815C→T，1833T→C，1845T→C，1894C→G，1902C→T）。

2.4 PEDV S抗原表位氨基酸的變化分析 利用DNAStar中的MegAlign對比華南地區毒株CH/GDGZ/2012 與 CV777、Chinju99、Br1/87、DR13、SM98氨基酸序列的同源性分別為97.7%、91.5%、95.4%、98.0%、94.8%。具體變化為：502aa L→S，516aa S→A，548aa T→S，593aa G→S，632aa Q→E（是分別由1 509bp C→T，1 545bpG→T，1 642bp A→G，1 777bp G→A、1 782bp T→C，1 894bp C→G）。這些說明華南地區的PEDV朝著不同的方向變異，有其地緣性。

圖2 CH/GDGZ/2012的遺傳進化樹

3 討論

Kim S J和 Kwon H M［8－9］等指出和 PEDV 同為冠狀病毒TGEV只有1個血清型，然而對比其部分S基因發現不同國家地區存在多樣性。同樣的PEDV也只有1個血清型，但學者對比分析M和N基因，發現不同國家的PEDV呈現多樣性，即使同一地區PEDV也存在不同［10－11］。相對于M、N 基因，S基因是PEDV高變基因，同時也是主要的抗原基因，利用S基因對比序列分析更能反映該病毒的變異性。此次試驗通過對比S基因主要抗原位點（1 495～1 914bp），分析華南地區與經典毒株的差異性。

華南地區分離到的CH/GDGZ/2012和CH/GD－01/2011、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011等毒株則位于G1.1.1，與經典疫苗毒株處于不同的分支，遺傳距離較遠，且其S基因主要抗原表位已經發生較大變異，可能導致經典疫苗產生的抗體不能對感染仔豬產生完全的保護，也與豬場病毒性腹瀉疫苗防疫效果不佳的現狀相符，可能是2010年冬季至今豬病毒性腹瀉大暴發的重要原因。值得注意的是，華南地區的PEDV毒株與泰國2008年、2011年分離毒的親緣關系很近，該病毒在兩國間及國內如何傳播值得進一步研究。

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