解毒通絡方含藥血清對大鼠血管成纖維細胞釋放ET、NO、MMP-9的影響1）

魏陵博，戎冬梅，李運倫，遲立萍，鐘志歡，吉中強，焦華琛

成纖維細胞（CFs）增殖是多數心臟疾患病理改變的基礎。成纖維細胞具有分泌功能，能夠分泌釋放內皮素（ET）、一氧化氮（NO）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等，基質金屬蛋白酶（MMP）可導致細胞外基質的過度降解，ET 可誘導心肌細胞肥大和刺激膠原合成，能加重心臟經皮冠狀動脈介入治療（PCI）后再狹窄的發生，一氧化氮（NO）是保護性因子，有阻止再狹窄發生的作用。本研究用解毒通絡方含藥血清干預新生大鼠主動脈成纖維細胞的培養，測定培養液血清中 MMP、ET、NO的含量，初步揭示該方對再狹窄的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 1d～4d齡新生清潔級SD大鼠，雌雄不限，購自山東中醫藥大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥品 解毒通絡方合劑組成：黃連12g，大黃3g，連翹15g，野葛根30g，水蛭6g，地龍12g。由山東中醫藥大學中藥學院按制備合劑的常規方法制成滅菌合劑，1mL相當于生藥材1g。

含藥血清制備：取健康Wistar雄性大鼠12只，灌服解毒通絡方合劑，每次按2mL／100g的體積給藥（大約相當于60kg成人日劑量的15倍）。灌胃前12h禁食不禁水，每日1次，連續給藥7d。于末次給藥2h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，置無菌試管內。待凝固后37℃水浴1h，3 000r／min，離心15min，分離血清，-20℃冰箱保存備用。臨用時，56℃恒溫30min滅活，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。含藥血清呈淡黃清亮透明液體。

卡托普利：濟南東風制藥有限公司產品，用DMEM／F12培養基溶解、過濾除菌，4℃冰箱保存備用。

1.1.3 主要試劑 AngⅡ、胰蛋白酶，Sigma公司產品；DMEM培養基，賽默飛世爾生物化學制品有限公司產品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產品；NO酶聯免疫測定試劑盒，美國R＆D公司產品；內皮素酶聯免疫測定試劑盒，美國R＆D公司產品；波形蛋白單克隆抗體產品、纖維連接蛋白單克隆抗體產品、α-肌動蛋白單克隆抗體產品和SABC試劑盒，均為武漢博士德工程有限公司產品。

1.1.4 實驗儀器 EL340I全自動酶標儀，美國Biotok公司產品；BB16uv／BB5060uv CO2培養箱，Heraeus公司產品；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司產品；XDS-1B型倒置顯微鏡，重慶光電公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與鑒定 采用組織貼塊法培養大鼠胸主動脈成纖維細胞，胰蛋白酶消化法作傳代培養，倒置相差顯微鏡下觀察并作血管成纖維細胞α-actin和Vimentin免疫細胞化學染色進行鑒定，選用4～8代血管成纖維細胞用于實驗。

1.2.2 細胞分組與干預 胰蛋白酶消化制備細胞懸液，調整細胞密度為1×106／L，接種于培養板／瓶備用。經48h預培養和24h無血清培養基預處理后，隨機分組。①DMSO溶媒對照組：10%FBS的DMEM培養基、1%DMSO，不加特殊處理因素；② AngⅡ組：AngⅡ終濃度為2×10-7mol／L、10%FBS的DMEM培養基；③卡托普利組：AngⅡ終濃度為2×10-7mol／L＋卡托普利400mg／L；④含藥血清高、中、低、極低劑量組：AngⅡ終濃度為2×10-7mol／L＋含藥血清20%、15%、10%、5%。繼續培養24h，胰蛋白酶消化培養細胞。

1.2.3 細胞培養液ET、NO和MMP-9含量的測定 采用酶聯免疫吸附法，具體步驟見試劑盒說明書。

1.2.4 統計學處理 實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時采用秩和檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠胸主動脈成纖維細胞培養結果 CFS為貼壁生長型細胞，CFS呈長梭形或不規則多角形，細胞質透明，向外伸出2個～3個長短不一的突起，胞核比較大，細胞界限較清楚，生長排列較規律，多呈放射狀、編織狀或螺旋狀走行。成纖維細胞α-actin和Vimentin免疫細胞化學染色，發現細胞Vimentin單抗染色陽性，胞漿中有棕黃色絲狀網絡及顆粒，而α-actin單抗染色表達陰性。

2.2 各組培養液中ET、NO、MMP-9水平比較（見表1）

表1 解毒通絡合劑含藥血清對大鼠血管成纖維細胞ET、NO、MMP-9的影響（x±s）

3 討 論

PCI已逐漸成為治療冠狀動脈硬化性血管內狹窄的有效方法，但是，超過15%的冠狀動脈支架置入患者在一年內因為支架內再狹窄而接受新的介入治療［1］。賈國良等［2］認為PCI后冠狀動脈再狹窄與冠狀動脈對血管成形損傷的過度修復有關，支架置入幾分鐘后內膜表面就覆蓋一層纖維蛋白原，并伴有血小板的黏附、聚集、活化，誘發中膜與外膜平滑肌細胞和成纖維細胞向內膜遷移、增殖，并合成大量的細胞外基質，發生基質改建，幾周后被顯微平滑肌細胞和纖維細胞組織代替，形成新生內膜，發生內皮化。

陳康玉等［3］指出，炎癥反應參與了從早期的血管損傷到最終的內膜增生等整個再狹窄過程。

既往研究證明［4，5］，解毒通絡方劑能有效減輕大鼠炎癥性尾部血栓形成，能明顯降低動物血清中IL-1的含量，對不穩定型心絞痛有較好的療效，既能對抗炎癥因子，又有抗血栓形成作用，符合冠狀動脈支架內再狹窄的機制。本研究觀察其對成纖維細胞產生MMP-9、ET、NO的作用，以期揭示對再狹窄發生的影響。

本研究顯示，解毒通絡方含藥血清各個劑量組與卡托普利組都能顯著降低大鼠主動脈成纖維細胞ET的含量，增加NO含量，ET是目前已知的體內作用最強的縮血管活性多肽，具有明確的促平滑肌細胞增殖的作用，在心血管疾病中起著重要作用，特別是與心肌纖維化有密切的關系［6］。NO具有舒張血管，抑制血小板黏附聚集的作用。有證據表明［7］PTCA／支架術后血小板生成的NO顯著減少，而且NO合成酶和L-精氨酸（L-Arg）的跨膜運轉也降低，NO由左旋精氨酸氧化途徑產生，其合成限速酶NO調節著NO的合成與釋放。

MMPs是一類鋅依賴性蛋白酶家族，有20余種，主要包括MMP-1、MMP-2和 MMP-9。MMP-s是降解細胞外基質成分的主要酶類，其活性的增加能促進動脈粥樣硬化形成中基質的重建。Ikeda等［8］研究表明，支架術后冠脈再狹窄組 MMP-2和MMP-9的水平均明顯高于術后血管正常組，上述指標隨冠脈再狹窄的加重程度進一步升高。

多項研究表明，血清MMP-9水平在冠心病心絞痛患者中明顯升高，病情越重，升高越顯著，血清MMP-9水平增高與冠狀動脈病變程度密切相關［9，10］。本實驗顯示，高劑量組與卡托普利組均能顯著降低MMP-9的水平，其他劑量組無此作用。

再狹窄是冠心病介入治療后的主要遠期并發癥。在再狹窄的發生過程中，ET、NO、MMP-9均是重要的細胞因子。本研究觀察了解毒通絡法對新生大鼠CFs分泌的ET、NO、MMP-9的作用，證明解毒通絡法是通過降低ET／NO值、降低MMP-9水平來實現防止再狹窄的。

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