陰虛血虧大鼠模型血管活性腸肽表達及心肌超微結構的改變

李 浩

心血管調節肽廣泛分布于中樞神經系統和心血管系統，是一個非常復雜、非常龐大的神經體液調節網絡。從這些生物活性物質的分布和作用來看，中樞神經系統和心血管系統之間的功能關系密切。血管活性腸肽（vasoacitve intestinal peptide，VIP）對循環系統具有擴張血管、降低血壓、增加心率、增強心肌收縮力和舒張冠脈血管的作用［1］，與其受體垂體腺苷酸環化酶激活肽特異性結合，還具有抑制心肌成纖維細胞增殖的作用，與多種心血管疾病密切相關，如高血壓病、心肌病、心力衰竭等。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠20只，體重200g±20g，由華中科技大學同濟醫學院提供，批號：00002829。隨機分為空白對照組、模型組，每組10只。實驗前將各組大鼠放在同一籠中適應飼養2周，自由攝食、飲水。室溫和水溫均控制在22℃～24℃。

1.2 試劑及藥物 D-半乳糖：上海試劑二廠生產，批號為070124；咖啡因：購自美國Sigma公司；VIP抗兔／鼠通用型免疫組化試劑盒，購自 Gene tech company limited，貨號為GK500705；其他如10%水合氯醛、2.5%戊二醛、10%多聚甲醛、1%四氧化鋨等為市售常用試劑。

1.3 儀器 日立H-600型透射電鏡（日本日立公司），LKB-V型超薄切片機（瑞典BROMMA公司）。

1.4 方法

1.4.1 陰虧血虛大鼠模型的建立 參照文獻［2］方法制作陰虧血虛大鼠模型，模型組按60mg／（kg·d）標準頸背部皮下注射D-半乳糖4周，按30mg／（kg·d）標準腹腔注射咖啡因1周，空白對照組常規飼養。所用動物給藥時間均為每晚18：00。

1.4.2 免疫組化法測定模型大鼠心臟VIP 各組大鼠處理完畢，用10%水合氯醛0.3mL／100g麻醉大鼠，處死大鼠。迅速打開胸腔摘取心臟，置4℃預冷勻漿介質中洗去殘血。由右室游離壁沿心臟長軸切開，取小塊心肌用10%多聚甲醛溶液固定48h以上，自來水沖洗48h，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。以4%多聚甲醛溶液300mL灌注約30min內固定。取腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定48h。自來水沖洗12 h，經70%、80%、95%酒精梯度脫水各12h，正丁醇脫水6h。取出組織，低溫（60℃）浸蠟過夜，包埋、連續切片，片厚4μm，切片每隔3張取1張。

石蠟切片置于65℃烘箱中，烘片2h，用PBS（pH7.4）沖洗3次，每次5min；EDTA微波修復；自然冷卻后PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；切片放入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育15 min；PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；甩去 PBS液，加第一抗體；每張切片加入約50μL稀釋液，4℃過夜；PBS（pH7.4）洗3次，每次5min；甩去PBS液，每張切片加50μL～100μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色；顯色完全后，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化1min，自來水沖洗，氨水返藍1 min，流水沖洗；切片經過梯度酒精70%、80%、95%脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

圖像采集每組取8份標本，各隨機取5個視野，顯微鏡下觀察，采用HPIAS-1000多媒體彩色病理圖文分析系統，對免疫組化VIP陽性細胞（胞體完整，染色呈棕色或深棕色）進行計數。

1.4.3 心肌組織電鏡標本的制備 如前各組大鼠處理完畢，取小塊心肌用2.5%戊二醛前固定24h，0.1mol／L磷酸緩沖液漂洗3次，鋨酸（OsO41%）后固定24h，0.1mol／L磷酸緩沖液漂洗3次，梯度酒精脫水（50%、70%、80%、95%、100%二次）每次15min，純丙酮脫水二次（15min），EPON812：丙酮（1∶1）浸透30min，純包埋液浸透1h，純包埋液固化37℃24h后60℃48 h，切片機切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0軟件包進行統計分析。

2 結 果

2.1 大鼠VIP水平實驗結果（見表1）

表1 天王補心丹對大鼠血漿VIP水平的影響（x±s）

2.2 心肌組織透射電鏡下超微結構的改變 空白對照組心肌細胞核大，肌原纖維清晰規整，橫紋清楚，肌節無皺縮；胞質內肌漿網正常，無管壁溶解；線粒體排列整齊，內、外膜完整，基質密度適中，線粒體嵴完整，排列整齊。模型組大鼠心肌組織的改變有：心肌肌絲排列紊亂、斷裂，肌小節排列紊亂、斷裂；大部分心肌細胞核結構正常，少數細胞核可見濃縮變小，染色質輕度溶解及凝聚，核膜皺縮尚完整；大部分線粒體形成高電子密度狀，內、外膜及嵴結構模糊，不清晰；肌漿網囊性擴張，成大囊泡狀，部分肌漿網破裂。

3 討 論

近年來，關于VIP和心血管系統關系的研究越來越多。心臟及血管活動受神經、體液等多種因素調控，VIP是重要的肽類神經遞質之一，其在心血管系統中也有著廣泛的分布，對心臟血管活動有重要的調節作用?，F代研究證明，VIP通過結合VIPC1、VIPC2、PAC1特異性受體，激活cAMP依賴蛋白激酶A（PKA），cGMP依賴蛋白激酶G（PKG）等多種途徑起到調節血管的作用［3-5］。同時，VIP對心臟活動也有著重要的調節作用。有實驗證明VIP可以加快心率［6］。并在心力衰竭的發病發展過程中起著重要作用。其作用機制與VIP參與恢復血液動力平衡、提高心肌功能、對抗其他神經內分泌系統如腎素-血管緊張素系統激活引起的副反應有關［7，8］。

本實驗研究結果顯示，模型組VIP含量顯著升高，而同時心肌結構受到損害，電鏡觀察心肌的超微結構顯示心肌肌絲排列紊亂、斷裂，少數細胞核可見濃縮變小，染色質輕度溶解及凝聚，核膜皺縮，線粒體形成高電子密度狀，嵴結構模糊，不清晰，肌漿網囊性擴張，成大囊泡狀，部分肌漿網破裂。VIP作為參與心衰發生發展的重要體液因子，提示模型組大鼠可能已經出現心功能不全。而VIP可能參與了心肌結構損害的過程。

［1］ DvorákováMC.Cardioprotective role of the VIP signaling system［J］.Timely Top Med Cardiovasc Dis，2005，3（9）：E33.

［2］ 黃攀攀，王平，李貴海，等.老年陰虛失眠動物模型的建立與評價［J］.中華中醫藥學刊，2010，28（8）：1719-1723.

［3］ Pasyk E，Mao YK，Abroad S，et al.A endothelial cell-line rontains functional vasoactive intestinal poly-peptide receptors：They control inwardly rectifying K＋channels［J］.Eur J Pharmacol，1992，212（2-3）：209-214.

［4］ White CM，Ji S，Cai H，et al.Therapeutic potential of vasoactive intestinal peptide and its receptors in neurological disorders［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2010，9（5）：661-666.

［5］ Keef KD，Shutt leworth CW，Xue C，et al.Relationship between nitric oxide and vasoactive intestinal popypetidein in enteric inhibitory neurotransmission［J］.Neuropharmacology，1994，33（11）：1303-1317.

［6］ Kuncova J，Faitova S，Capouch J，et al.Chronic atropine administration diminishes the contribution of vasoactive intestinal polypeptide to heart rate regulation［J］.Physiol Res，2008，57（6）：827-829.

［7］ Lucia P，Caiola S，Coppola A，et al.Vasoactive intestinal peptide（VIP）：A new neuroendocrine marker of clinical progression in chronic heart failure［J］.Clin Endocrinol（Oxf），2003，59（6）：723-727.

［8］ Kupari M，Mikkola TS，Turto H，et al.Vasoactive intestinal peptide release from the heart and response in heart failure due to left ventricular pressure overload［J］.Eur J Heart Fail，2006，8（4）：361-365.