四妙勇安湯提取物抑制巨噬細胞NF-κB活化和MMP-9分泌的初步研究1）

朱海燕，聶 波，徐 冰，劉 蓓，吳圣賢，陳立新

四妙勇安湯是用于治療下肢動脈閉塞癥和脈管炎的傳統(tǒng)名方，由于其活血祛瘀、通絡(luò)止痛的作用與冠心病心絞痛的病因病機相吻合，故在臨床亦觀察到其可改善冠心病心絞痛患者的臨床癥狀［1］。本課題組前期研究已證實，四妙勇安湯對治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者臨床癥狀具有較滿意的療效。但因原方中藥量過大，給新藥開發(fā)帶來難度。本實驗采用對易損斑塊穩(wěn)定性起重要作用的巨噬細胞為研究對象，通過對NF-κB活化和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）分泌的測定，探索四妙勇安湯的有效組分，為藥物的下一步研發(fā)提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 小鼠巨噬細胞系（RAW264.7細胞），中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，96孔白色底透培養(yǎng)板（Costa）。

1.2 試劑及耗材 640培養(yǎng)基，小牛血清，LPS（Sigma），MMP-9 ELISA試劑盒（Jiamay Biotech Co），水套式CO2細胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本），Safire2高速多通道連續(xù)波長酶標(biāo)儀（TECAN，奧地利），Bright-Glo Luciferase熒光素酶檢測試劑（Promega），48孔和96孔培養(yǎng)板（Costar）。

1.3 樣品制備 “四妙勇安湯”提取物共8個。方法：原料藥材55%乙醇提取2次，1.5h／次，得到55%乙醇提取液和殘渣，55%乙醇提取液濃縮至干，水混懸，上大孔樹脂，連續(xù)依次采用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇淋洗，分別獲得水部位、30%乙醇部位、60%乙醇部位、95%乙醇部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品2號～5號；殘渣用水提2次，1.5h／次，得到水提液，留取部分水提液濃縮至干得到樣品1，其余用水混懸，上大孔樹脂，連續(xù)依次采用水、55%乙醇、95%乙醇淋洗，分別獲得水部位、55%乙醇部位、95%乙醇部位，分別減壓濃縮干燥，得到篩選樣品6號～8號。

1.4 細胞培養(yǎng)、造模方法和抑制率的檢測 RAW264.7細胞在37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)于含10%小牛血清1640培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶內(nèi)對數(shù)生長的RAW264.7細胞消化并計數(shù)，以10×104／well的密度接種于48孔培養(yǎng)板中。模型制備前，換以等體積無血清1640培養(yǎng)基，待篩樣品與細胞預(yù)先孵育1h。模型制備時，每孔加入終濃度為5μg／mL LPS，與細胞共同作用24h，收集細胞上清，之后每孔加入50μL Bright-Glo Luciferase熒光素酶檢測試劑，室溫避光震蕩5min，置于多功能酶標(biāo)儀中，設(shè)定光化學(xué)檢測程序進行檢測。該模型以熒光素酶光化學(xué)值的變化直接指示樣品對NF-κB-RE是否有阻斷作用。因此，通過計算抑制率，可確定樣品在NF-κB信號通路中對早期基因表達阻斷作用的強弱。

以ELISA法檢測MMP-9含量。根據(jù)ELISA說明書逐步操作，最后在酶標(biāo)儀450nm處讀出OD值。以標(biāo)準品濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D 450值為縱坐標(biāo)，繪制濃度OD450標(biāo)準曲線。根據(jù)樣品的OD值從標(biāo)準曲線上查出待測樣品作用后的濃度，并通過與模型組比較，觀察樣品對MMP-9的抑制作用。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS13.0分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示。

2 結(jié) 果

2.1 細胞上清液中MMP-9的含量測定 在正常培養(yǎng)的RAW264.7細胞上清中，MMP-9含量較低；LPS作用24h后，MMP-9含量顯著增高。初篩結(jié)果顯示，1、2、3、4、6、7、8號提取物能夠降低細胞上清MMP-9含量，提示可能具有降低RAW264.7細胞中MMP-9產(chǎn)生及分泌的作用，故對上述7種提取物進行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果顯示，1、2、4號提取物在5μg／mL～100μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關(guān)系；3、6號提取物在5μg／mL～50μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關(guān)系；7、8號提取物在5μg／mL～25μg／mL范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關(guān)系。（注：7、8號提取物在50μg／mL時即出現(xiàn)細胞毒性作用，故復(fù)篩時二者濃度均未高于50μg／mL）。

表1 提取物對LPS致巨噬細胞損傷模型上清MMP-9含量的影響（x±s，n=3）

2.2 提取物對NF-κB反應(yīng)原件結(jié)合抑制劑篩選模型的作用1、2、3、4、6、7號提取物對 NF-κB信號通路具有阻斷作用，能夠通過抑制早期基因表達而抑制該病理信號通路。（注：8號提取物在100μg／mL和50μg／mL時出現(xiàn)細胞毒性作用，故計算濃度未高于50μg／mL）。詳見表2。

表2 提取物對NF-κB反應(yīng)原件結(jié)合抑制劑篩選模型的作用（x±s，n=3）

3 討 論

隨著“動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)”學(xué)說的公認，清熱解毒中藥已成為治療冠心病的常用中藥［2］。四妙勇安湯配伍精當(dāng)，藥專力宏，是最具中醫(yī)配伍和用量特色的藥物之一，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、生甘草組成，具有抑菌、消炎、促進血液循環(huán)等作用，常用于治療氣滯血瘀、靜脈阻塞而發(fā)的脈管炎、血栓閉塞性脈管炎［3］。而冠心病心絞痛的基本病機是氣虛血瘀，病理機制為絡(luò)脈癖阻細急而痛［4］，與四妙勇安湯方證相吻合。四妙勇安湯可改善冠心病心絞痛患者的臨床癥狀［1］。本課題組前期研究也證實，對冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者臨床癥狀具有較滿意的療效。

本實驗采用巨噬細胞系RAW264.7細胞作為研究材料，并通過LPS刺激活化巨噬細胞。在眾多的炎細胞中，巨噬細胞對斑塊穩(wěn)定性的作用尤為重要。活化的巨噬細胞除了是形成動脈粥樣硬化病變的主要組成部分，還可在炎癥因子的刺激下分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，降解斑塊中的膠原和細胞外基質(zhì)成分，使纖維帽變薄，易于形成不穩(wěn)定性斑塊。其中，最主要的是MMP-9，它對細胞外基質(zhì)合成與降解的平衡起重要作用，其在冠狀動脈動脈壁和外周血中的增加程度與病變嚴重程度正相關(guān)［5］。本次實驗結(jié)果顯示：四妙勇安湯的1、2、4號提取物在5μg／mL～100 μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用巨噬細胞系RAW264.7細胞后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關(guān)系；3、6號提取物在5μg／mL～50μg／mL濃度范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后MMP-9的分泌，具有濃度依賴關(guān)系；7、8號提取物在5 μg／mL～25μg／mL范圍內(nèi)能夠明顯降低LPS作用后 MMP-9的分泌，具有濃度依賴關(guān)系。結(jié)果提示四妙勇安湯的部分提取物可抑制巨噬細胞分泌MMP-9，因此可能具有減少斑塊基質(zhì)降解，穩(wěn)定斑塊的作用。

MMP-9主要在轉(zhuǎn)錄水平受NF-κB、AP-1等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)［6］，目前許多學(xué)者認為NF-κB的激活是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的始動機制之一［7］。本研究選擇不穩(wěn)定型心絞痛易損斑塊炎癥反應(yīng)的核心病理環(huán)節(jié)——NF-κB，對四妙勇安湯全部連續(xù)組分進行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)四妙勇安湯抑制NF-κB信號通路的有效部位分別為位1、2、3、4、6、7。其中有效部位2、3、4的IC50值較低，表明抑制效果最好。

綜合MMP-9和NF-κB被抑制的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯有效部位1、2、3、4、6的作用較為安全可靠。此外，在篩選出中藥有效部位的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化中藥配伍和配比關(guān)系，對于進一步開發(fā)抗不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定易損斑塊有效中藥具有重要意義。

［1］ 許恒忠，李金英，蘇子德.四妙永安湯加味治療冠心病心絞痛的療效觀察［J］.邯鄲醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校學(xué)報，2005，18（1）：45-46.

［2］ 吳同和.清熱解毒法對不穩(wěn)定性心絞痛患者C反應(yīng)蛋白的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2006，26（11）：43-44.

［3］ 賴天松.中西醫(yī)匯通常用方劑［M］.廣州：廣東科技出版社，1999：117.

［4］ 吳以嶺.從絡(luò)病學(xué)說論治冠心病心絞痛［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7（4）：71.

［5］ Gough PJ，Gomez IG，Wille PT，et al.Macrophage expression of active MMP-9induces acute plaque disruption in apoE-deficient mice［J］.J Clin Invest，2006，116（1）：59-69.

［6］ Luttun A，Lutgens E，Manderveld A，et al.Loss of matrix metalloproteinase-9or matrix metalloproteinase-12protects apolipoprotein E-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth［J］.Circulation，2004，109（11）：1408-1414.

［7］ Zandi E，Chen Y，Karin M.Direct phosphorylation of IkappaB by IKKalpha and IKKbeta：Discrimination between free and NF-kappaB-bound substrate［J］.Science，1998，281（5381）：1360-1363.