丹參注射液對(duì)腦梗死患者自體外周血干細(xì)胞旁分泌BDNF的影響1）

趙 寧，楊萬章，李 嬌，戴 映，楊志剛

正常情況下，外周血中的造血干細(xì)胞（PBHSC）數(shù)量很少，重組粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）已經(jīng)廣泛用于PBHSC動(dòng)員治療缺血性心腦血管疾病［1］，rhG-CSF本身也可通過抗氧化、抗炎等作用促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)［2］。丹參具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的作用［3］。本研究旨在觀察丹參注射液及rhG-CSF治療前后腦梗死患者外周血BDNF表達(dá)的變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年5月—2012年2月我院住院治療的年齡40歲～75歲腦梗死恢復(fù)期患者60例，符合《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》和《中風(fēng)病診斷與療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》（試行）診斷標(biāo)準(zhǔn)，平均發(fā)病時(shí)間15d～64d。按照納入時(shí)間先后隨機(jī)分為4組，各15例。丹參＋rhG-CSF組15例，男9例，女6例，年齡（51.66±9.43）歲；rhG-CSF組15例，男8例，女7例，年齡（50.60±8.57）歲；丹參組15例，男10例，女5例，年齡（55.0±11.23）歲；常規(guī)組15例，男12例，女3例，年齡（55.26±11.68）歲。4組患者性別、年齡、病程、危險(xiǎn)因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。排除短暫性腦缺血發(fā)作、腦出血（經(jīng)CT診斷）、出血性腦梗死及蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦外傷、腦腫瘤、腦寄生蟲、代謝障礙引起的偏癱、風(fēng)濕性心臟病、冠心病及其他合并房顫所引起的腦栓塞者等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)藥物 重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（商品名：吉粒芬，杭州九源基因工程有限公司，批號(hào)：011705）；丹參注射液含生藥1.5g／mL（杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：02011102）。

1.2.2 試驗(yàn)方法 常規(guī)組：常規(guī)治療予康復(fù)訓(xùn)練，包括偏癱肢體綜合訓(xùn)練、關(guān)節(jié)松動(dòng)、運(yùn)動(dòng)療法、手功能訓(xùn)練、言語構(gòu)音訓(xùn)練、神經(jīng)肌肉電刺激、日常生活能力訓(xùn)練及針灸等，每天1次，3周為一個(gè)療程。抗血小板聚集藥、降壓藥、降糖藥、降脂藥等。丹參組：丹參注射液20mL／d靜脈輸注，連用7d，余治療同常規(guī)組。rhG-CSF組：在抽血檢查次日08：00皮下注射吉粒芬300 μg，連用3d，余治療同常規(guī)組。丹參＋rhG-CSF組：第1天開始連續(xù)使用丹參注射液20mL／d靜脈輸注7d，同時(shí)在丹參注射液滴注第2天08：00皮下注射rhG-CSF 300μg，連用3d，余治療同常規(guī)組。4組均以7d為1個(gè)療程。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 4組均在療程1d～7d次日晨采外周靜脈血標(biāo)本檢測(cè)，并做臨床評(píng)定。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫（ELISA）法。樣品稀釋：以50μL待測(cè)血清樣品＋250μL樣品稀釋液將待測(cè)樣品稀釋5倍。實(shí)驗(yàn)過程：加入30μL血清到含120μL酸-乙醇提取液的EP管中；振蕩并在室溫下?lián)u晃孵育30min；以10 000r／min離心5min，再轉(zhuǎn)移100μL上清液到含200μL三羥甲基氨基甲烷緩沖液 （pH=7.6）的EP管中，充分混勻。加入300μL試驗(yàn)稀釋液A，充分混勻，立即檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)，各組治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

丹參＋rhG-CSF組、rhG-CSF組治療前后BDNF比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與常規(guī)組治療后比較，丹參＋rhGCSF組、rhG-CSF組BDNF差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；丹參＋rhG-CSF組與丹參組、常規(guī)組治療前后差值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；rhG-CSF組與丹參組、常規(guī)組治療前后差值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 4組治療前后血清BDNF的變化（x±s） ng／mL

3 討 論

BDNF是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)合成的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化及生長(zhǎng)有著重要的作用［4］。BDNF在中樞神經(jīng)元中可能通過TrkB受體介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 （extracellular signal-related kinases，ERKS）and Beta-連環(huán)蛋白（B-catenin）磷酸化來促進(jìn)神經(jīng)元的成熟及重塑，促進(jìn)軸突再生［5］。Keng等［6］發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)損傷大鼠中，移植BDNF轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞能明顯促進(jìn)髓鞘形成、組織再生以及血管的發(fā)生，促進(jìn)功能修復(fù)。Haiying等［7］運(yùn)用BDNF基因修飾過的神經(jīng)干細(xì)胞治療創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠，發(fā)現(xiàn)修飾后的干細(xì)胞能過度表達(dá)BDNFmRNA，移植后細(xì)胞存活的數(shù)量和比例、突觸前及突觸后蛋白的表達(dá)及神經(jīng)元標(biāo)識(shí)物Tubulin表達(dá)，明顯高于未經(jīng)修飾的干細(xì)胞治療組，同時(shí)干細(xì)胞本身還分泌幾種營(yíng)養(yǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）及胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factors，IGFs），其中 VEGF主要是通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF同時(shí)分泌多種組織蛋白酶，誘導(dǎo)新生血管形成［8］。BFGF能促進(jìn)中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞分裂的多肽，具有強(qiáng)烈的血管生成作用［9］。IGFs是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞增殖［10］，BDNF的表達(dá)通過干預(yù)PI3K／Akt信號(hào)通路［11］調(diào)控上述營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，并有相互影響作用，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、血管生成及細(xì)胞的增殖［12］。

丹參為唇形科植物，味苦，性微寒，具有活血祛瘀、養(yǎng)血安神、調(diào)經(jīng)止痛、涼血消癰的功效。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為“一味丹參，功同四物”。近年來，學(xué)者們對(duì)丹參作為誘導(dǎo)劑，對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞等作用做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)丹參的有效成分在體外實(shí)驗(yàn)中其可促進(jìn)植入的BMSCs向損傷部位定向募集，同時(shí)向神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)元標(biāo)志物絲蛋白（Nerulfilament protein，NF）的方向分化，且分化效率較高［13-15］。陳麗麗等［16］研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽可以明顯降低急性癲癇痙攣性大鼠的發(fā)作等級(jí)和發(fā)作時(shí)間，可能通過BDNF的表達(dá)增高來發(fā)揮作用。張偉駿等［17］研究發(fā)現(xiàn)，活血祛瘀解郁法治療卒中后抑郁癥的大鼠，與模型組相比，給藥組大鼠海馬表現(xiàn)為BDNF陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，認(rèn)為中藥活血祛瘀解郁方治療PSD能增強(qiáng)BDNF的表達(dá)，進(jìn)一步保護(hù)受損的5-HT、NE等神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元的再生，增加遞質(zhì)濃度，改善其活性，促進(jìn)功能恢復(fù)，達(dá)到改善神經(jīng)損傷和抗抑郁的作用。李云等［18］發(fā)現(xiàn)，腦卒中急性期患者神經(jīng)功能缺損程度與血清BDNF含量呈負(fù)相關(guān)。

本研究與上述學(xué)者的部分研究結(jié)果相似，丹參與rhG-CSF配伍用藥組、rhG-CSF單獨(dú)用藥組，均能明顯提高BDNF的表達(dá)。丹參組及常規(guī)組不能明顯提高BDNF的表達(dá)，考慮可能兩組中自體骨髓中的干細(xì)胞未經(jīng)重組粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員，外周血中干細(xì)胞的數(shù)目及濃度偏低，因而相應(yīng)的分泌腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子較少有關(guān)。rhG-CSF用作自體骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑，它有外源性干細(xì)胞無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。近10余年來，該藥被擴(kuò)大用于缺血性心腦血管病，在目前國(guó)內(nèi)外眾多的實(shí)驗(yàn)與臨床研究中，發(fā)現(xiàn)該藥有神經(jīng)保護(hù)和再生作用，包括修復(fù)神經(jīng)祖細(xì)胞，減輕腦水腫，提高生存率，促進(jìn)感覺和運(yùn)動(dòng)功能［19-21］。本研究認(rèn)為二者配伍使用可能與通過促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生BDNF有關(guān)，腦缺血再灌注損傷后級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致自由基、興奮性氨基酸、ET、iNO等過度產(chǎn)生，二者配伍使用以及rhG-CSF單獨(dú)使用在一定程度上能抑制此反應(yīng)，誘導(dǎo)BDNFmRNA、BDNF蛋白上調(diào)，并延長(zhǎng)其高表達(dá)時(shí)程，保護(hù)并促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)能。

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