近平滑假絲酵母發酵產甘露醇

魏文婷，張濤，江波，沐萬孟，繆銘

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

甘露醇是一種天然糖醇，許多水果和蔬菜如南瓜、蘑菇、洋蔥和海藻，尤其是褐色海藻中均有存在［1］。甘露醇具有不吸濕，甜度適宜，熱量低，無毒副作用，在人體內代謝與胰島素無關，不提高血糖值，不致齲齒等特點，可用作糖尿病人、肥胖病人的甜味劑和功能性食品添加劑［2］。在目前工業化生產甘露醇所采用的方法中，除提取法外，其他方法均伴有副產物山梨醇的產生，不僅降低了原料轉化為甘露醇的轉化率，也為甘露醇的分離和純化帶來了困難［3］。而發酵法能夠利用酶系統完成立體有選擇的氫化作用，所得的甘露醇產率高且不產生山梨醇［4］，具有選擇性高，反應條件溫和的優勢［5］。

自然界中許多微生物可以發酵生產甘露醇，如細菌、酵母菌、真菌等［6－8］。近些年人們多關注于異型發酵的乳酸菌、明串珠菌，它們主要將果糖轉化為甘露醇［9］。YUN［10］等研究了2 株乳酸菌產甘露醇的條件，它們利用100 g/L果糖分別得到73和26 g/L的甘露醇。侯建革［11］等采用布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)發酵48 h產生甘露醇68.5 g/L，培養基總糖為 150 g/L，其中果糖與葡萄糖比值為 3∶1。Song［7］等篩選出1株木蘭假絲酵母，利用150 g/L果糖搖瓶培養168 h可產生67 g/L甘露醇。但果糖作為底物相對比較昂貴，不利于工業化生產，為了降低生產成本，必需選擇廉價的底物［12］。

為了克服上述缺點，本文首先從甘蔗汁中篩選出1株利用葡萄糖產甘露醇的菌株，經鑒定為近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)。它能以高濃度葡萄糖為原料得到較高產量的甘露醇，且不必添加果糖。葡萄糖價格相對低廉，并且大量存在于自然界中，降低了生產成本，這對于今后工業化制備甘露醇具有較大的應用價值。本文在單因素實驗基礎上，使用正交實驗設計優化得到了發酵產甘露醇的最佳培養基，并利用此培養基進行30 L發酵分批培養，探索利用該菌種發酵產甘露醇工業化生產條件。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)，保藏于中國典型培養物保藏中心，編號為CCTCC No.M 2012491。

1.1.2 培養基

富集培養基(g/L):葡萄糖 500，酵母膏 10，pH 5.0。

篩選培養基(g/L):葡萄糖500，酵母膏10，瓊脂20，pH 5.0。

斜面保藏培養基(g/L):葡萄糖20，酵母膏 20，瓊脂 20，pH 5.0。

種子培養基(g/L):葡萄糖 20，酵母膏 20，pH 5.0。

初始發酵培養基(g/L):葡萄糖150，酵母膏20，MgSO42，KH2PO42，pH 5.0。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀;Agilent 1260;分離柱;Sugarpak-1鈣型陽離子交換柱;檢測器;Shodex RI-101示差折光檢測器;30 L發酵罐;揚中市威柯特生物工程設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種篩選方法

取自然放置72 h的甘蔗汁(市購)10 mL接種于100 mL已滅菌的富集培養基中，30℃搖床培養48 h，然后取1 mL培養液梯度稀釋涂布于篩選培養基上，倒置于30℃培養箱中，培養48 h。利用高濃度葡萄糖形成的高滲透壓(低水活度)環境進行初篩，觀察微生物生長情況，用接種環挑選微生物形態、大小、色澤等不同的菌落進行3次平板劃線純化，得到的純菌落轉接到斜面培養基中培養48 h保存。從斜面培養基上挑取1環接種到初始發酵培養基中進行復篩，發酵條件為30℃，200 r/min，培養72 h。發酵結束后將發酵液10 000 r/min離心20 min取上清液，用HPLC檢測上清液中是否有甘露醇存在。

1.3.2 培養方法

將生長良好的斜面菌種1環，接種于種子培養基培養，培養條件:30℃，200 r/min，培養24 h。然后以4%接種量接種于裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，培養條件:30℃，200 r/min，培養72 h。

1.3.3 生物量的測定

離心干重法:發酵液30 mL在4 000 r/min下離心10 min收集細胞，蒸餾水洗滌2次再離心，60℃烘干至恒重。

1.3.4 甘露醇產量和葡萄糖的含量

甘露醇和葡萄糖測定:HPLC法。將發酵液10 000 r/min離心20 min，取上清液，經0.45 μm 膜過濾后用HPLC檢測發酵液中甘露醇產量和葡萄糖的含量。

色譜條件:流動相:純水(經0.45 μm膜過濾);流速:0.4 mL/min，柱溫:85 ℃;進樣量:10 μL。

1.3.5 葡萄糖和果糖對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響

改變初始發酵培養基里的碳源，分別以葡萄糖、葡萄糖和果糖質量比分別為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的混合物以及果糖作為不同的碳源進行研究，碳源總濃度均為150 g/L;其次考慮最適碳源的濃度對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響。

1.3.6 氮源對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響

改變初始發酵培養基里的氮源，研究不同種類氮源(酵母膏、牛肉膏、麥芽浸膏、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨以及尿素)對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響;其次考察最適氮源的添加量。

1.3.7 無機鹽對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響

分別以不同濃度梯度的無機鹽(CaCl2·2H2O、FeCl3·2H2O、MgSO4·7H2O、CoCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、NiCl2·2H2O 以及 MnSO4·4H2O)添加到初始發酵培養基中，比較無機鹽對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響。

1.3.8 正交實驗設計

根據單因素實驗結果，以葡萄糖、酵母膏、CaCl2·2H2O、FeCl3·2H2O以及MgSO4·7H2O濃度為5因素，設計L16(45)正交實驗。

1.3.9 30 L發酵罐分批培養

根據正交實驗所得優化培養基，將近平滑假絲酵母在30 L發酵罐中進行分批培養，接種量為4%，初始 pH 5.0，30 ℃，通氣量0.5 vvm，轉速 200 r/min，定期取樣測定發酵過程中生物量、pH、葡萄糖以及甘露醇含量的變化情況。

2 結果和討論

2.1 菌種篩選和鑒定

2.1.1 高效液相對樣品的檢測結果

利用以高濃度葡萄糖為唯一碳源的富集培養基和篩選培養基，從甘蔗汁中分離得到的SK26.001產甘露醇能力最高，其HPLC測定結果如圖1和圖2所示。菌株產生的菌落呈粘稠污白色，顯微鏡下為單細胞個體，呈球形橢圓形等，未見芽殖及假絲菌，如圖3所示。

圖1 葡萄糖和甘露醇標樣的HPLC圖Fig.1 HPLC profiles of standard glucose and mannitol

圖2 發酵液HPLC圖Fig.2 HPLC profiles of fermentation liquid

圖3 菌株SK26.001的細胞形態(×400)Fig.3 The morphology of the strain SK26.001(×400)

2.1.2 菌種鑒定結果

進行18S rDNA測序，結果表明:菌株SK26.001的18S rDNA序列含有1446個堿基。將該序列進行BLAST比 對 發 現，該 菌 株 與 C.parapsilosis BG090809.6.8.4.1.12(JQ008831.1)同源性最高，18S rDNA序列同源性達100%。依據形態學、生理生化特性等特征，參照細菌鑒定手冊［13］，結合18S rDNA序列比對結果，鑒定SK26.001為近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)。將 C.parapsilosis SK26.001的18S rDNA序列提交到GenBank得到登錄號為KF255835，并將其保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No.M 2012491。

2.2 葡萄糖和果糖對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響

研究不同配比的葡萄糖和果糖對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響，結果見圖4。

圖4 不同配比碳源對發酵過程的影響Fig.4 Effect of different proportion of carbon sources on fermentation

從圖4可以看出，雖然利用不同配比的葡萄糖和果糖都能獲得與葡萄糖接近的生物量，但甘露醇的產量都不及僅以葡萄糖為碳源時的產量高，這說明近平滑假絲酵母代謝不同糖類的機制可能不同，影響到細胞內 mannitol dehydrogenase、mannitol-1-phosphatase的活力和合成［1］，最終造成甘露醇的合成受限。近平滑假絲酵母以果糖為碳源也可以產生少量的甘露醇，但是果糖的存在反而減少甘露醇的生成，隨著果糖比例的增加，甘露醇的產量隨之減少。因此，選擇葡萄糖作為唯一碳源，并研究不同濃度葡萄糖對產甘露醇的影響。

從圖5可以清晰看出，葡萄糖含量為200 g/L時獲得最大的甘露醇產量，但隨著糖含量進一步增加，甘露醇產量反而降低，這是因為甘露醇受底物葡萄糖濃度的影響，葡萄糖濃度過大，不僅對菌體生長抑制作用增加，也影響甘露醇的轉化生成，這可能是由于滲透壓過高而引起的［7］，酵母通過胞內積累多元醇等相容性溶質來適應高滲環境生長，甘油被認為是主要的相容性溶質［14］。這些相容性溶質可以以較高的濃度在細胞內積累而對細胞酶系出現抑制或滅活［15］。

圖5 葡萄糖濃度對發酵過程的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on fermentation

2.3 氮源對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響

氮源對甘露醇發酵的影響，結果如圖6所示。由圖6可知，氮源對甘露醇發酵影響比較大，其中酵母膏的效果最好。酵母膏富含完全蛋白質，均衡的必需氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等，是最為理想的生物培養基原料和發酵工業中的主要原料，其功效與8倍的酵母相當，可以大大提高菌種的生產速率及發酵產品得率。因此，確定酵母膏為近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的最適氮源，再研究不同濃度酵母膏對產甘露醇的影響。

由圖7可知，在酵母膏濃度低于10 g/L時，產物甘露醇的生成量相對較低;當酵母膏濃度低于5 g/L時，菌體量不高，這說明低的酵母膏濃度不能滿足菌體的生長;當酵母膏濃度高于20 g/L時，菌體量相對變化不大，此可以判斷此時的酵母膏的量對于菌體的生長已經滿足，但產物甘露醇的生成量隨著酵母膏濃度的增大而增加，在酵母膏濃度為25 g/L時達到最大，此時發酵得到的甘露醇產量為39.1 g/L。

2.4 無機鹽對近平滑假絲酵母發酵產甘露醇的影響

圖6 氮源種類對發酵過程的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources on fermentation

圖7 酵母膏濃度對發酵過程的影響Fig.7 Effect of the concentration of yeast extract on fermentation

從圖8可以看出，CaCl2·2H2O、FeCl3·2H2O可以明顯提高甘露醇的產量，而MgSO4·7H2O能夠略微促進甘露醇的生成，它們的最佳濃度分別為0.1 g/L、0.02 g/L、0.2 g/L，其中添加 0.02 g/L FeCl3·2H2O時甘露醇的產量達到55 g/L。據研究發現，Ca2+可以減少胞內甘露醇含量，Cu2+可以增加甘露醇脫氫酶的活力［16］，然而Cu2+對近平滑假絲酵母產甘露醇卻沒有促進作用。Mg2+一般是微生物代謝路徑里很多酶的激活劑，在糖酵解、呼吸、氧化磷酸化等過程中起重要作用［17］;而Fe3+是細胞色素和鐵氧化還原蛋白的氧化還原反應中必不可少的電子載體，在電子傳遞體系中起至關重要的作用，微生物對Fe3+的需求是微量的，濃度過高會引起抑制或毒害作用［18］。從圖9可以看出CoCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O 嚴重阻礙甘露醇的生成，而 NiCl2·2H2O、MnSO4·4H2O也對甘露醇的生成有一定影響。某些蛋白質容易受Co2+影響而變性;Cu2+是多種生物過程的基本輔酶，當Cu2+過量時會促使產生活性氧化物，與生物大分子(如蛋白質)結合，從而破壞該大分子的正常生理功能［19］。推測其余幾種金屬離子也是影響了代謝途徑中某些酶的合成和活力而使甘露醇產量減少。

圖8 無機鹽離子對發酵過程的影響ⅠFig.8 Effect of inorganic salt ions on fermentationⅠ

圖9 無機鹽離子對發酵過程的影響ⅡFig.9 Effect of inorganic salt ions on fermentationⅡ

2.5 正交優化實驗結果

考慮到各因素間的交互作用對甘露醇發酵的影響，在單因素實驗的基礎上，設計L16(45)正交實驗，實驗因素及水平見表1，實驗結果見表2。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2極差分析可知，各因素影響甘露醇產量的順序為:B＞D＞A＞C＞E，即酵母膏＞FeCl3＞葡萄糖＞CaCl2＞MgSO4，可以確定最優條件為:A2B4C3D2E4，即葡萄糖濃度為200 g/L，酵母膏濃度為30 g/L，CaCl2·2H2O濃度為0.05 g/L，FeCl3·2H2O濃度為0.02 g/L，MgSO4·7H2O濃度為0.5 g/L。在此條件下進行搖瓶培養，甘露醇產量達到61.7 g/L。

2.6 30 L發酵罐分批培養

為了研究近平滑假絲酵母的細胞生長情況和代謝規律，進行分批發酵，將優化后的發酵培養基一次性加入30 L發酵罐中，發酵過程不流加底物葡萄糖，直至發酵結束。發酵液中甘露醇含量、葡萄糖含量、pH、生物量的變化情況，結果見圖10。由圖10可知，在前30 h酵母細胞快速生長，隨后進入穩定期，之后生物量仍有略微增長。初始pH為5，對數期時pH下降為3.7，這是由于產生了乳酸等酸性物質［21］，然而72 h后pH又略有回升，這可能是由于葡萄糖耗盡引起的代謝變化，因此在發酵過程中要控制pH值來促進甘露醇的產生。葡萄糖在前24 h呈線性消耗，主要是用來提供菌體生長;24 h后葡萄糖一方面是用來提供菌體生長，另一方面用來合成甘露醇，在72 h時葡萄糖完全耗盡，此時甘露醇產量達到最大值80.3 g/L。甘露醇在前18 h時沒有產生，這段時間是菌體的快速增長期。值得注意的是，當培養基中葡萄糖用盡時，近平滑假絲酵母開始代謝已經生成的甘露醇，這表明甘露醇作為碳源被消耗用來維持菌體生長，這與Gaspar P［20］報道的同型發酵乳酸菌在培養基中葡萄糖用盡的情況下代謝已經生成的甘露醇的情況相一致。由此可以考慮嘗試在發酵中期補充葡萄糖和控制pH等方法來提高甘露醇的產量。

表2 正交實驗結果和極差分析Table 2 The results of the orthogonal experiment and range analysis

3 結論

圖10 近平滑假絲酵母的發酵曲線Fig.10 The curve of fermentation of C.parapsilosis

從甘蔗汁中篩選出了1株能利用葡萄糖產甘露醇的菌株，經鑒定為近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)。通過單因素實驗和正交實驗，得到其產甘露醇的最佳條件為200 g/L葡萄糖，30 g/L酵母膏，0.05 g/L CaCl2·2H2O，0.02 g/L FeCl3·2H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，在此條件下搖瓶培養得到的甘露醇產量為61.7 g/L。以葡萄糖為底物要優于以果糖為底物，甘露醇產量在葡萄糖濃度為200 g/L時達到最高，葡萄糖濃度過高反而抑制甘露醇的生成。進行30 L發酵罐分批培養，根據發酵曲線得知72 h時甘露醇最大產量為80.3 g/L。本研究獲得的菌株具有應用于實際生產的潛能，其結果為高效、低成本工業化生產和應用奠定了基礎，進一步的發酵過程研究目前還在進行中。

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