Egr-1誘騙性寡脫氧核苷酸對大鼠動脈損傷后PCNA和CDK4表達的影響

河北省邯鄲市中心醫院心內科（邯鄲056001） 王泰然 馬 巍 宋文奇

心血管疾病是目前世界上引起人類死亡的主要疾病之一。其中，冠心病（Coronary artery Disease，CAD）是最重要的因心血管疾病死亡的根本原因。經皮冠狀動脈介入治療（Percutaneous coronary intervention，PCI）方法在過去的20年中發展得非常迅速，已經成為治療CAD的重要手段。然而，血管成形術后再狹窄（Restenosis，RS）的出現，仍然是影響其中長期療效的重要因素。RS的本質特征是血管損傷后，血管中膜平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）向內膜下的遷移、增殖以及產生大量的細胞外基質。近3年來，藥物涂層支架的應用，明顯降低了術后再狹窄率＜1 0%，但涂層支架的使用也存在較大問題：在抑制血管平滑肌細胞增殖的同時也抑制了血管壁的內皮細胞生長，使內皮層愈合延遲，不利于內皮細胞功能的改善［1，2］。

隨著分子生物學的發展，基因治療再狹窄可能是一種很有前景的治療方法［3］。早期生長反應因子-1（Early growth response factor-1，Egr-1）是一種鋅指結構轉錄因子（Transcription factor，TF），調控著多種增殖相關基因的表達［4，5］。在外源性刺激時Egr-1表達增多，促進細胞增殖和血管內膜增生，導致RS等病理性血管修復反應，抑制其表達能夠有效防止VSMC的異常增生，從而達到治療疾病的目的［6］。人們日漸關注以TF為靶點在核轉錄水平進行阻斷的基因干預治療方法［7］。其中誘騙寡脫氧核苷酸（Decoy oligodeoxynucleotides，Decoy-ODNs）技術是將與TF靶相結合位點（順式作用元件）序列相同的人工合成雙鏈寡脫氧核苷酸導入細胞內，競爭性誘騙TF與其結合，使TF所調控的能促進細胞增殖的下游基因表達受抑，從而在轉錄水平上達到抑制細胞增殖的目的［8］。本實驗擬通過觀察Egr1Decoy-ODN對球囊損傷后大鼠血管Egr-1增殖細胞核抗原（PCNA）和細胞周期蛋白依賴激酶（CDK4）表達的影響，來探討Decoy ODN防治RS的作用機制，為實際應用Decoy-ODN防治RS提供進一步的實驗依據。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：健康雄性Wistar大白鼠，體質量350～400g，由北京維通利華實驗動物中心提供，合格證號SCXK（京）2006-0009。

1.2 主要儀器與試劑：2FFogarty導管（美國Baxter health corporation），倒置顯微鏡（日本OLYMPU S），手動輪轉切片機（德國Lecia RM 2235Lecia），醫學圖像照相系統（日本Olympus BX51），醫學圖像分析系統（日本Olympus DP2-BSW），手術器材：剪刀，血管夾，止血鉗，手術縫針及縫線，注射器等，小型臺式離心機（美國SIGMA1-13），紫外分光光度計（日本UV-3000），實時熒光定量PCR擴增儀：（美國ABI PRISM R7500Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems）。轉染試劑FuGene6（瑞 士Ro c h e公 司），Egr-1兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），CDK4兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），PCNA兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），Decoy-ODN（大連寶生物工程有限公司），總RT-PCR提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）RT-PCR逆轉錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），RT-PCR引物（寶生物工程大連有限公司）。

2 實驗方法

2.1 大鼠頸動脈損傷的模型制作：健康雄性Wistar大鼠96只，體重350～400g。10%水合氯醛（300mg／kg）麻醉后，頸正中切開，暴露左頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，用血管夾暫時阻斷左頸總動脈和頸內動脈，用2F導管從頸外動脈插入向前推進至主動脈弓，推入生理鹽水充盈氣囊，沿頸總動脈全長回撤，然后抽癟氣囊。這個過程重復三次，且每次回撤時導管旋轉90度。造成左頸總動脈內膜損傷。術后結扎頸外動脈，恢復血流，縫合頸部創口。局部使用青霉素以預防感染，喂食標準飼料，自由飲水。

2.2 分組及處理：96只雄性Wistar大白鼠隨機分為4組，每組24只。假手術組：只進行頸動脈結扎，但不插入導管，即不造成動脈內膜損傷。單純損傷組：球囊拉傷左頸總動脈。SCR組：球囊拉傷左頸總動脈后局部注入200μl含有500μg SCR-ODN、30μl轉染試劑FuGene6的1mM MgCl2液。Decoy-ODN+Fu-Gene6治療組：球囊拉傷左頸總動脈后，應用微量注射器局部釋放200μl含有500μg FITC標記的decoy ODN、30μl轉染試劑FuGene6的lmM MgCl2溶液，使其在局部作用20min。

2.3 Egr-1誘騙及誘騙對照寡脫氧核苷酸（Decoy-ODNs和Decoy-ODNs SCR）的設計合成：Egr-1的誘騙寡脫氧核苷酸（decoy ODNs）基因序列為：上游5'-TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG-3'，下游3'-AGCGGGGGCGGGGG-CGATTCCC-5'。Egr-1的誘騙對照寡脫氧核苷酸（Decoy ODNs SCR）基因序列為：同誘騙序列類似的錯配雙鏈寡脫氧核苷酸，上游5'-AGCCGCACCGGC-CTGCCTCGTC-3'，下游3'-TCGGCGTGGCCGGACGGAGCAG-5'。經聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化并凍干保存，在其3'和5'端進行硫代修飾，部分寡核苷酸的5'端用FITC標記，以便于在熒光顯微鏡下觀察轉染后基因的分布情況。

2.4 在體Decoy ODN轉染：室溫下分別將500μg Decoy-ODNs與30μl轉染試劑FuGene6充分混合成復合物后溶于170μl的lmm MgCl2液中，在制作血管球囊損傷模型的同時，從頸外動脈將混合液局部注入至損傷的血管節段內。在熒光顯微鏡下觀察轉染情況。于轉染24h后處死大鼠2只，立即取治療局部的血管放入液氮罐中，經制成冰凍切片（片厚5μm）后，避光于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 血管標本的病理學檢查：各組血管用石蠟包埋后，從每段血管的橫截面隨機切下3張切片（片厚5μm），HE染色，光鏡顯微鏡下觀察血管內膜增生情況，并應用計算機圖像分析軟件進行圖象分析，每個標本間隔取3張切片，用計算機圖像分析軟件測量，計算出內膜面積、中膜面積、管腔面積和內膜與中膜（I／M）的面積比。圖像分析由操作熟練但不知情者操作。

2.6 Real time RT-PCR法檢測血管壁組織的Egr-1、PCNA和CDK4mRNA表達：采用Trizol一步法提取血管組織總RNA，取各組總RNA3μl逆轉錄合成cDNA，逆轉錄反應根據逆轉錄試劑盒要求的標準進行，反應總體積為20μl，反應條件為37℃15min，85℃5s，4℃7min。以2μg cDNA為模板進行PCR擴增，總反應體系為20μl，2μl 的 cDNA，10μl 的SYBRRPremix Ex TaqTM，0.4μl的引物和7.2μl的超純水。主要的循環參數如下：1個循環的預變性（95°C 30s），40個循環的退火（95°C 5s）和延伸（60°C 34s）。Egr-1上游引物5'-CCCAAACT- GGAGGAGATGA-3'，下游引物5'-GAGGCAGAGGAAGACGATG-3'。PCNA上游引物5'-GGGGTGAAGTTTTCTGCGAG-3'，下游引物 5'-CGATCTTGGGA-GCCAAATAATAC-3'。CDK4上 游引物5'-CCAGGACCTACGGACATA-3'，下游引物5'-TACAGCCAACACTCCACAT-3'。β-actin上游引物5'-CGTGCGTGA-C ATTAAAGAG-3'，下游引物5'-TTGCCGATAGTGATGACCT-3'。β-actin作為每個樣品的內參。每個目的基因的CT平均值減去對應模板的內參照基因的CT平均值，得到△CT，根據公式：△CT（樣本）＝目的組基因CT-對照基因內參CT；△CT（對照）＝對照組基因CT-對照基因內參CT；△△CT＝△CT（樣本）-△CT（對照）；因此樣本目的基因的相對表達量＝2-△△CT［9］。實驗重復3次。

2.7 采用Western blot法檢測血管壁組織的Egr-1、CDK4和PCNA的蛋白表達：提取各組動脈總蛋白，將含有50μg總蛋白的樣品用SDSPAGE分離，并轉移到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉過夜，用TBS液清洗兩遍，然后加入1∶400稀釋的一抗（Egr-1、PCNA和CDK4）中室溫下孵育2h。辣根過氧化物酶標記一抗，化學發光試劑增強反應。凝膠成像分析系統測定條帶的平均積分光密度值，記錄結果。以β-actin蛋白表達為內參照，目的蛋白和β-actin條帶平均積分光密度比值表示目的蛋白的相對含量。

3 統計學分析 所有的檢測數據用均數±標準差表示，使用SPSS13.0軟件進行統計分析。用單因素方差分析進行數據分析，組間比較采用LSD法，當P＜0.05，結果被認為具有統計學意義。

結 果

1 在體轉染效果觀察 轉染24h后，收集血管標本，然后在470～490nm的熒光顯微鏡下觀察，以確定轉染效率。轉染Egr-1decoy ODN基因24h后，可見血管內膜和中膜有大量綠色熒光分布，證明轉染成功（圖1）。

圖1 Decoy-ODN轉染后24h，可見殘存內膜及中膜大量綠色熒光分布（×100）

2 血管病理形態學檢測結果 假手術組，血管內膜由一層完整的內皮細胞覆蓋，無內膜增生，管腔無狹窄；大鼠頸總動脈拉傷后3d，可見內皮剝脫，無新生內膜增生，管腔無狹窄，說明球囊拉傷動脈模型成功；單純損傷組和SCR組7d時可見內膜增生，管腔狹窄，14d、2ld時內膜增生更明顯，內膜及中膜層有大量的增生細胞，排列紊亂，內彈力板模糊，管腔明顯狹窄。Decoy-ODN組與同一時間點單純損傷組和SCR組相比，內膜增生受到抑制（圖2），差異有顯著性（P＜0.01，見附表）。

圖2 I為新生內膜，M為中膜，IEL為內彈力板，黑色線段表示新生內膜厚度。

附表 Egr-1decoy ODN對球囊損傷后新生內膜增生的影響（±s，n＝24）

附表 Egr-1decoy ODN對球囊損傷后新生內膜增生的影響（±s，n＝24）

注：LA為管腔面積，I為新生內膜面積，M為中膜面積，I／M為內膜面積與中膜面積比值。與同一時間點的injury-only組和SCR組比較★P＜0.01，＃P＜0.01；與同一時間的假手術組、injury-only組和SCR組比較▲P＞0.05。面積單位：μm2。

組 別 指標7d 14d 21d Sham LA 0.481±0.030 0.483±0.014 0.485±0.035 I ---M 0.136±0.013 0.128±0.025 0.134±0.017 I／M - - -injury-only LA 0.413±0.007 0.391±0.025 0.300±0.028 I 0.092±0.013 0.123±0.024 0.215±0.020 M 0.137±0.008 0.134±0.011 0.130±0.005 I／M 0.673±0.105 0.919±0.159 1.682±0.126 SCR LA 0.400±0.022 0.385±0.010 0.289±0.012 I 0.101±0.023 0.128±0.012 0.229±0.018 M 0.140±0.015 0.129±0.007 0.133±0.009 I／M 0.709±0.113 0.991±0.009 1.732±0.159 Decoy LA 0.461±0.023＃ 0.441±0.022＃ 0.440±0.015＃I 0.044±0.007＃ 0.055±0.016＃ 0.073±0.016＃M 0.134±0.019▲ 0.130±0.023▲ 0.136±0.021▲I／M 0.335±0.048★ 0.427±0.123★ 0.543±0.153★

3 血管壁Egr-1、PNCA和CDK4mRNA表達結果 假手術組大鼠動脈Egr-1、PCNA CDK4mRNA的表達微弱，血管球囊損傷后Egr-1、PCNA和CDK4 mRNA的表達增加，Egr-1的表達高峰在21d，單純損傷組和SCR組表達分別是假手術組的18.05±1.22倍和18.38±1.57倍，PCNA mRNA的高峰在7d，單純損傷組和SCR組表達分別是假手術組的6.28±0.64倍和6.58±0.62倍；CDK4mRNA的高峰在7d，單純損傷組和SCR組表達分別是假手術組的4.92±0.40倍和5.28±0.43倍，經Decoy-ODN治療后，在各個時間點Egr-1、PCNA和CDK4mRNA的表達明顯減少，與單純損傷組和SCR組比較有顯著差異（P＜0.001）

圖3 Egr-1Decoy-ODN對Egr-1、PCNA和CDK4mRNA的表達的影響。

4 Western blot檢測血管壁Egr-1、PCNA和CDK4表達結果 假手術組Egr-1和CDK4蛋白微弱表達，血管球囊損傷后Egr-1和CDK4的表達同其mRNA的表達類似。Egr-1的表達隨著時間的延長，表達逐漸增高，在21d，免疫印跡帶達到最強；而CDK4免疫印跡帶的最強度為7d，Decoy-ODN治療組，蛋白表達較SCR組和對照組相比顯著減弱（圖4）。

討 論

PCI是治療冠心病的重要手段，然而PCI術后的再狹窄卻嚴重影響其遠期療效［10］。近年來，對其發生機制及防治的研究一直是研究的熱點。目前對PCI術后再狹窄的治療研究已經深入到基因水平。近期的研究發現有多種核TF（包括Egr-1）調控著VSMC增殖相關基因的表達，通過干預這些TF的轉錄翻譯過程能夠抑制VSMC增殖，達到抑制球囊損傷后內膜過度增生和RS的目的［11，12］。TF是一類DNA結合蛋白，它與基因啟動子中特定序列（即順式作用元件）相結合而調節下游靶基因的轉錄表達［13］。

圖4 Western blot法檢測不同時間點各組血管組織目的蛋白表達變化

Egr-1是一種鋅指結構轉錄因子，在正常血管壁中低水平表達或不表達，而在動脈損傷和其它多種刺激可誘導血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）及內皮細胞表達，誘導VSMC的分裂、增殖和內膜增生［14］。SANTIAGO等［15］利用Egr-1反義核苷酸成功地抑制了動脈損傷后Egr-1在VSMC中的表達及VSMC增殖。這表明Egr-1在VSMC的增殖過程中起重要的調控作用。因此干預Egr-1轉錄因子基因表達，以抑制VSMC增殖，減輕內膜增生，可能為再狹窄防治策略的制定提供了新的思路和選擇。

TF誘騙策略是一種針對TF的在核轉錄水平的基因沉默治療方法。TF Decoy-ODNs能競爭性結合活化的TF序列特異識別結構域，快速有效的抑制TF與啟動子調控序列的特異性結合，從而抑制下游基因的轉錄起始［13］。常用的Decoy-ODNs為小分子的雙鏈DNA，與反義ODNs相比有許多優點，如雙鏈結構穩定；分子量小，易于合成；具有特異性的靶向結合位點；能抑制啟動子區域內由同一順式作用元件調控的多個基因等。首先報道的應用誘騙技術調控基因表達的實驗是將E2FDecoy-ODNs轉導入球囊損傷的大鼠頸動脈，結果顯著抑制了球囊損傷后2周內的新生內膜形成。隨后有人利用NF-κB Decoy-ODNs也顯著減輕了球囊損傷后鼠頸動脈新生內膜的生成。近年來國內有研究證明證實了轉染Egr-1Decoy-ODNs能夠有效抑制球囊損傷后大鼠頸動脈新生內膜的過度增殖，其作用機制可能為抑制堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）或改善內皮功能。

近年來研究表明，血管平滑肌細胞的增殖和遷移受多種因子（生長因子和炎性因子等）、多條途徑調控，且呈網絡狀分布，而細胞周期可能是調控平滑肌細胞增殖的最終交匯點。G1→S期調控點（即G1／S限制點）是哺乳動物細胞周期調控中的兩個主要調控點之一，控制著細胞從G1進入S期，決定了細胞對外界增殖信號的反應（進入有絲分裂，發生凋亡或進入靜止期修復損傷DNA）。細胞周期的進展依賴于細胞周期素（Cyclin）、細胞周期依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）以及細胞周期依賴性激酶抑制蛋白（CDK inhibitors，CKIs）的相互作用。CyclinD1作為G1期調控蛋白與CDK4形成的復合物在G1→S期轉換中起關鍵作用。另一項研究報告，轉染針對CDK2的反義寡核苷酸至球囊損傷的動脈可以抑制內膜增厚。最近的一項研究證實，應用藥物干預調節細胞周期，可以抑制血管平滑肌細胞增殖，從而阻止內膜增生。因此，抑制血管平滑肌細胞周期的進程一直被視為一個控制血管平滑肌細胞增殖的有效策略。

PCNA基因屬于與細胞增殖周期相關基因，在細胞的增殖啟動過程中起重要作用。PCNA主要在細胞核表達，它作為DNA合成酶δ的輔基，為細胞增殖所必需，細胞分裂時協助DNA引導鏈和隨從鏈的合成；PCNA可以與CDK和Cyclin結合促進細胞增殖；它是DNA復制和細胞分裂過程中DNA多聚酶最重要的輔助因子。在G1后期開始表達，S期達高峰，G2和M期開始下降，靜止期細胞表達很少，其量的變化與DNA合成一致，因此可作為評價細胞增生的一個指標。

本研究結果表明，正常的血管壁Egr-1、PCNA和CDK4微量表達，球囊損傷后，Egr-1、PCNA和CDK4表達上調，經Decoy-ODNs治療后，各個時間點均較SCR組和對照組明顯減輕。表明Decoy-ODN是一種新型的RNA水平上的強效基因滅活因子，通過抑制Egr-1的表達，在某種程度上也抑制了PCNA和CDK4的轉錄與表達，從而阻斷細胞周期進程，來抑制動脈損傷后內膜的增生。

本實驗成功地從轉錄水平抑制了VSMC的增殖和內膜增生，為臨床治療再狹窄提供了實驗基礎。本研究雖然證明可以減輕血管損傷后內膜增生程度，但未能完全抑制內膜增生，考慮有其他因素參與血管損傷后內膜增生，這有待于進一步研究。

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