雙黃乳膏不同皮膚體外擴散的實驗研究

王 敏 趙 婷 龔慕辛 尚雅文 張 超

(首都醫科大學，北京，100069)

雙黃乳膏是由黃連、黃柏等組成的外用乳膏，具有清熱解毒、消炎止痛作用，主要用于各種肌腱扭傷、挫傷所致之紅腫熱痛。本實驗就透皮吸收促進劑－氮酮用量對有效成分鹽酸小檗堿體外經皮滲透的影響進行考察，為進一步篩選處方做準備。有關雙黃巴布劑中鹽酸小檗堿透皮吸收的研究已有報道[1－2]，但均采用大鼠皮，本實驗利用蛇蛻、小鼠皮膚研究體外經皮擴散的情況。

1 材料與儀器

1.1 材料與試藥 黃連、黃柏等飲片70%醇提物(自制)，氯化鈉(北京化工廠，批號20021122)，羊毛脂(北京市昌平石鷹化工廠，991102)，液體石蠟(北京求賢化工試劑廠，批號211003021)，月桂氮酮(北京化學試劑公司，批號041202)，尼泊金乙酯(中國醫藥公司北京采購供應站，批號910709)，三乙醇胺(北京化學試劑工廠，批號930901)，硬脂酸(北京益利精細化學品有限公司，批號20000717)，甘油(北京市嘉利佳工貿有限公司)，蒸餾水。烏梢蛇蛇蛻(整條，購于安國藥市);雄性ICR小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號:SCXK(京)2006－0009)。

1.2 儀器 智能透皮試驗儀(YB－P6，天津市富蘭斯電子科貿有限公司)，超聲波清洗機(KQ－500，昆山市超聲儀器有限公司)，紫外分光光度計(UV－1800PC，上海美普達儀器有限公司)，電動脫毛器(市購)。

2 方法

2.1 雙黃乳膏的制備 取硬脂酸6.13 g、液體石蠟10 mL、羊毛脂1.12 g，氮酮(乳膏A加1 mL，乳膏B加4 mL)置小燒杯中，在75℃水浴加熱并攪拌使其熔化，備用。另取尼泊金乙酯0.2 g溶于甘油2 mL與三乙醇胺2 mL、適量水和制成水相，水浴加熱至75℃，備用，將油相緩慢加入水相中，邊加邊沿同一方向用玻璃棒充分攪拌，使充分乳化成稠膏狀，加入適量藥物70%乙醇提取浸膏研勻，即得含藥物浸膏5%的乳膏A、B。

2.2 標準曲線的制備 精密稱取鹽酸小檗堿5.0 mg，用0.9%的氯化鈉溶液溶解，置于100 mL容量瓶內定容，制成濃度為0.05 mg/mL對照品母液，分別吸取不同量母液于10 mL容量瓶內，配制成濃度依次為0.045、0.02、0.01、0.005、0.001 mg/mL 的對照品溶液，后分別取不同量濃度為0.005 mg/mL的對照品溶液置于10 mL容量瓶內，配制成濃度依次為0.000 5、0.000 2、0.000 1 mg/mL的對照品溶液。將此8個濃度的對照品溶液用紫外分光光度計于265 nm處測定吸光度，作線性擬合，求出標準曲線方程為 Y=61.588X+0.004 4，相關系數r=0.999 9，說明鹽酸小檗堿濃度在0.000 1 mg/mL至0.045 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 滲透試驗用皮膚的處理

2.3.1 蛇蛻的處理 蛇蛻背部剪成適當大小，用生理鹽水洗凈并浸泡30 min后，用濾紙吸干表面水分，備用。

2.3.2 鼠皮的處理 取健康雄性ICR小鼠(30±2)g，斷脊髓處死，立即剪取背部、腹部皮膚，取下背部、腹部皮膚，先用手術剪剪去長毛，然后再用自動脫毛器剃凈剩余的短毛。仔細剝離皮下脂肪層和結締組織，用生理鹽水沖洗干凈，置生理鹽水中，低溫冰箱保存備用。實驗前自然解凍，并用濾紙吸干后使用。

2.4 經皮擴散操作方法 采用改良擴散池[3]，暴露皮膚面積為1.668 cm2，接收池容積為16.4 mL。接收池內放入小轉子，將剪好的完整蛇蛻、鼠腹皮、鼠背皮及固定在智能透皮試驗儀的擴散池與接收池之間，用夾子固定好，角質層向上，真皮一側與接收液相貼。用減重法精稱雙黃乳膏(A/B)0.5 g均勻、嚴密涂于擴散池暴露的皮膚表面。設定智能透皮試驗儀的條件:溫度37℃，水浴保持恒溫，轉速500 r/min(小轉子的)。分別在放入后的 0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h從接收池精密取2.0 mL釋放液，并立即補充等量恒溫的生理鹽水。

2.5 含量測定方法 以生理鹽水作空白對照，釋放液立即在265 nm處測定吸光度，記錄實驗數據。濃度較大超出紫外量程的，進行稀釋后測定。每組平行操作6次。以樣品液吸光度代入回歸方程求出樣品中鹽酸小檗堿的含量，得到累積透過量。Qn=Cn×V+Vr×其中，Cn表示第n個時間點的接收液藥物濃度(mg/mL)，V表示接收池內生理鹽水體積(V=16.4 mL)，Vr表示取樣體積(V=2 mL)，Ci為第i個時間點的接收液藥物濃度(mg/mL)，i=n－1。計算出累積透皮吸收量Q(mg)。

3 結果

1)雙黃乳膏A與雙黃乳膏B經蛇蛻和鼠皮透皮釋放不同時間累積量見表1。

表1 不同濃度氮酮乳膏鹽酸小檗堿累積透過量(Q±SD，μg，n=6)

表2 不同濃度氮酮乳膏鹽酸小檗堿經皮擴散速率(μg/h，n=6)

2)雙黃乳膏A與B經蛇蛻和鼠皮不同時間的累積透過量經線性回歸，直線的斜率即經皮擴散速率(μg/h)，回歸方程及相關系數r見表2。截距為負值即表示藥物經皮吸收有擴散時滯。

3)由表1可以看出:A乳膏鹽酸小檗堿累積透過量，小鼠腹皮是蛇蛻的15倍，小鼠背皮是蛇蛻的16倍;B乳膏鹽酸小檗堿累積透過量，小鼠腹皮是蛇蛻的31倍，小鼠背皮是蛇蛻的44倍。累積透過量為小鼠背皮＞小鼠腹皮＞蛇蛻。用小鼠腹部和背部皮膚進行經皮擴散試驗，雖然A乳膏累積透過量均呈現大于B乳膏的趨勢，但結果無統計學意義。采用蛇蛻時，A乳膏累積透過量大于B乳膏，結果有統計學意義(P=0.037)。

4 討論

氮酮為目前使用較多的促透劑，用量小、無毒且對皮膚的刺激性很低，對親水性或疏水性化合物均有較強的透皮吸收促進作用[4－5]，使用濃度為 0.1% ～10%，常用濃度為0.5% ～2%[6]。前人研究發現氮酮對不同藥物的透皮吸收影響不同，其用量并非越高越好，故對試驗藥物應選擇最佳用量[7－8]。本試驗考察了兩種不同濃度的氮酮對于雙黃乳膏12 h累積透過量和經皮擴散速率的影響，發現蛇蛻無論從累積透過量還是經皮擴散速率均能較好地區分兩者的差異，證明氮酮含量4%的乳膏中有效成分透皮吸收量和速率均低于氮酮含量1%的乳膏。而小鼠無論背皮還是腹皮試驗結果雖能看出氮酮含量4%的乳膏透皮存在時滯，但從累積透過量看差異無統計學意義，對兩者的區分度不佳。透皮吸收研究中實驗皮膚的選擇對預測藥物的透皮特性有重要意義，目前認為小豬、猴和蛇蛻等與人皮膚較為相似[9]，但由于皮膚來源的關系，大鼠、小鼠和兔皮仍常用作透皮吸收實驗皮膚，豚鼠皮也偶見報道[6]。本試驗也說明透皮吸收試驗選取皮膚不同，會影響試驗的結論。分析其原因如下。

蛇蛻是一種無毛囊的純角質層，厚度為10～20 μm，分β層(以β角蛋白為主)、中層(以α角蛋白和類脂為主)和α層(以α角蛋白為主)。β層對透過性影響不大，中層與α層是透過的主要屏障，中層結構與人角質層極相似，因此在結構、組成、脂類含量、水分滲透性等方面與人類表皮角質層類似。據文獻報道，藥物透過蛇蛻的滲透系數與其透過人皮的滲透系數相似或常略低，而其它動物表皮的滲透系數則遠大于人皮膚[10－11]。有實驗表明氮酮對蛇蛻的促透作用比小鼠皮更顯著，認為其主要作用部位可能是角質層[12]，這可能是采用蛇蛻做透過試驗對氮酮含量差異更敏感的原因之一。其次，蛇蛻表皮為一個完整薄層，能夠制備多個樣品;單個動物也可提供多次蛻皮，從而消除個體差異;蛻皮可在室溫下保存。蛇蛻缺少毛囊，可以避免經毛囊路徑的滲透，實驗結果穩定，個體差異小，容易比出差異。而小鼠的皮膚由于存在毛囊，在制備鼠皮時需要進行剃毛等操作，容易發生肉眼難以發現的皮膚損傷或剃毛不凈[11]，且同只小鼠可制備的皮張數量受到限制，因此引入較大的個體差異，實驗結果不易穩定[13]，難以比出差異。故蛇蛻作為體外透皮實驗的擴散膜其實驗數據會更有實際意義。因此，建議在進行透皮試驗時，應根據試驗目的選擇適宜的皮膚[14]。

此外，根據多次試驗發現，小鼠背部毛遠遠多于腹部，且背部皮膚較厚，皮下脂肪層和結締組織較難去凈[15];小鼠腹部皮膚毛少，較薄，皮下結締組織較易去凈，實驗結果相比與背部皮膚更穩定，差異較小。因此，小鼠腹部皮膚更適宜于做透皮吸收試驗。

本試驗選取蛇蛻進行體外透皮試驗，并與常用的小鼠背皮與腹皮進行了結果的對比，試驗結果可以為雙黃乳膏不同處方經人體透皮的差異提供參考。

[1]樓步青，黃海波.雙黃巴布劑體外透皮促進劑的篩選[J].時珍國醫國藥，2011，22(9):2247－2250.

[2]樓步青，黃海波，李玲慧，等.雙黃巴布劑體外經皮滲透實驗方法研究[J].時珍國醫國藥，2011，22(10):2490－2492.

[3]田璐，張蜀，林華慶，等.經皮給藥制劑體外透皮擴散試驗方法的研究進展[J].中國藥房，2012，23(29):2761－2764.

[4]符棘玉，周本宏，陳明，等.氮酮對布洛芬乳膏體外透皮吸收的影響[J].湖北中醫學院學報，2010，12(4):45－47.

[5]郭燕蓉，朱蔚，鄭媛.控哮涂劑與傳統三伏貼治療支氣管哮喘的療效觀察[J].世界中醫藥，2010，5(3):189－190.

[6]張星一.透皮吸收促進劑在經皮給藥系統中的質控和評價方法[J].中國新藥雜志，2010，19(4):273－276.

[7]殷立新，劉寶庫.氮酮對藥物透皮吸收的影響[J].西北藥學雜志，1998，13(2):87－88.

[8]張明偉.正交試驗法優選雌二醇凝膠處方[J].中國藥師，2011，14(7):1019－1020.

[9]邱波，王艷，胡建廷，等.SD大鼠與巴馬小型豬的皮膚組織學比較[J].中國比較醫學雜志，2012，22(6):14－15，20.

[10]羅世英，陳華萍.透皮吸收常用的幾種實驗動物[J].中國藥業，2004，13(4):74－75.

[11]祖強，趙曉莉，狄留慶，等.不同種類離體皮膚及人工合成膜對川芎貼膏體外透皮試驗的影響[J].江蘇藥學與臨床研究，2006，14(6):358－360.

[12]王寶華，項振玲，朱學慧，等，不同擴散膜對布洛芬乳膏體外經皮擴散實驗研究[J].天津藥學，2001，13(4):25－26.

[13]趙曉莉，狄留慶，祖強.藥物經皮給藥體內外評價方法研究進展[J].南京中醫藥大學學報，2008，24(3):214－216.

[14]潘林梅，周靜，徐小燕，等.中藥經皮給藥制劑促滲透研究策略與應用[J].中國藥房，2012，23(11):1039－1041.

[15]張英豐，汪小根，周莉玲.大鼠皮膚角質層對青藤堿脂質體貼劑透皮吸收的影響[J].中草藥，2006，37(9):1322－1324.