塞來昔布通過ERK1／2信號通路對肝癌細胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影響

西安交通大學醫學院第一附屬醫院（西安710061） 李 琛 于 良

肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其起病隱匿，病死率高，預后極差。肝癌在全球發病率呈逐步上升趨勢，但目前臨床尚無有效治療藥物。研究表明［1］，長期服用非甾體類抗炎藥物可降低消化道惡性腫瘤的發生率。本研究觀察塞來昔布對肝癌SMMC-7721細胞增殖、凋亡及COX-2、VEGF和ERK1／2表達的影響，并探討該作用與ERK1／2信號通路之間的關系，為其用于肝癌的治療提供理論依據。

材料與方法

1 試劑和儀器 主要試劑：人肝癌細胞株SMMC-7721購自第四軍醫大學細胞所；塞來昔布購自美國希爾大藥廠；新生胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜（DMSO）、四氮噻唑鹽（MTT）、胰蛋白酶、瓊脂糖均購自美國Sigma公司；雙抗購自山東魯抗制藥公司；兔抗人COX-2、ERK1／2多克隆抗體、羊抗人VEGF多克隆抗體購自SantaCruz公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司；SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒TaKa-Ra公司；PCR引物由上海生工公司合成。主要儀器：實時熒光定量PCR擴增儀購自美國 MJ公司；YCP-200CO2培養箱購自上海易亮醫療器械有限公司；電泳儀、轉移電泳槽和轉移電泳儀購自美國Bio-Rad公司；酶標儀（ELX800）購自美國BioTek公司；流式細胞儀購自BD公司。

2 細胞培養 人肝癌細胞株SMMC-7721置于含有10%的胎牛血清、100U／ml青霉素及100U／ml鏈霉素的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2的培養箱內培養。倒置顯微鏡下觀察細胞的生長，待細胞鋪滿瓶底的80%時進行傳代。實驗選用對數生長期細胞。

3 細胞生長抑制實驗 采用MTT比色法。SMMC-7721細胞接種于96孔板，培養24h后加無血清培養液常規培養24h，換含塞來昔布的培養液，終濃度分別為0、25、50、75和100μmol／L，0μmol／L組為對照組。每濃度4個復孔。分別在加藥后24、48和72h后，避光下加入新配制的 20μl MTT（5mg／ml），置37℃、5%二氧化碳培養箱內培養4h，棄培養液，加入二甲基亞砜（DMSO），10min后酶標儀測490nm處吸光度（A）值，根據公式計算細胞生長抑制率（IR）。IR的計算公式為：IR（%）=（對照組A值-實驗組A值）／對照組A值×100%。以上實驗均重復3次。

4 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞生長至對數生長期時，倒掉舊的培養液。設對照組與實驗組共5個組別。孵箱內細胞培育48h后終止培養，胰酶消化后分別制成單細胞懸液。調整待測細胞密度為5×105個／ml后上機檢測。

5 RT-PCR檢測SMMC-7721細胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表達 取對數生長期的SMMC-7721細胞，按照5×105／孔接種于6孔板中，24h待細胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度塞來昔布，不加入藥物的孔為對照組。細胞培養48h后，吸去培養液，PBS沖洗3次，用Trizol法提取細胞總RNA，按反轉錄反應試劑盒說明進行反轉錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴增COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA，GAPDH 為內參。各自引物序列分別是：COX-2F：5’-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3’R：5’-CATTCCTACCACCAGCAACC-3’，ERK1／2 F：5’-GGCTTTCTGACCGAGTATGTG-3’，R：5’-GGGTGTCTGTTCTTGTT AGGG-3’，VEGF F：5’-CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA GTA CC-3’R：5’-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3’，GAPDH F：5’-TCATCCCTGCCTCTACTG-3’R：5’-TGCTTCACCACCTTCTTG-3’。PCR反應條件為：94℃預變性5min，然后94℃變性30s，退火溫度56℃30s，72℃延伸40s，上述3步驟進行30個循環后，再94℃ 繼續延伸5min，置4℃ 保存。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統拍照用Quantity One軟件對照片進行灰度值掃描，以目的條帶與其相應內參GAPDH的光密度比代表目的基因mRNA的相對水平，實驗重復3次。

6 Western blot法檢測 COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達 收集各組細胞，用細胞裂解液裂解細胞并提取總蛋白。BCA法測蛋白濃度后，取40ug蛋白樣品進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1h后加入抗體孵育過夜。次日TBST洗膜后加入二抗，室溫1h后TBST洗膜3次。ECL浸泡后X片曝光，分析結果。所用內參為GAPDH。

7 統計學處理 所有數據以均數±標準差表示，采用SPSS 13.0軟件進行統計處理，應用單因素方差分析，以P＜0.05作為差異有統計學意義標準。

結 果

1 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細胞增殖的影響 見附表。不同濃度塞來昔布處理SMMC-7721細胞24、48、72h后，用MTT法測定細胞增殖，與對照組相比，各實驗組A值均有所降低，其中100μmol／L組A值降低更為明顯；抑制率隨藥物濃度增高、作用時間的延長而增高，同一時間點不同濃度組的抑制率之間的差異有統計學意義（P＜0.05）。表明塞來昔布能有效抑制SMMC-7721細胞的增殖，且抑制作用呈時間和劑量依賴性。

附表 細胞生長抑制試驗結果

2 塞來昔布對SMMC-7721細胞凋亡的影響見圖1。使用流式細胞術檢測細胞凋亡。流式細胞儀分析結果顯示，25、50、75和100μmol／L塞來昔布孵育SMMC-7721細胞后出現了明顯的凋亡，各實驗組的凋亡率與對照組相比，其差異有統計學意義（P＜0.05）；不同濃度塞來昔布處理后各組細胞凋亡率之間的差異有統計學意義（P＜0.05），SMMC-7721細胞的凋亡率隨著塞來昔布濃度的增加而增加。

圖1 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細胞凋亡率的影響

3 塞來昔布對SMMC-7721細胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表達的影響 見圖2。不同濃度的塞來昔布（25、50、75和100μmol／L）作用于SMMC-7721細胞24h后，與對照組相比，COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA的表達均明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.05），且隨塞來昔布濃度的增加，三者的表達均呈逐漸下調趨勢。

圖2 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細胞COX-2、VEGF和ERK1／2mRNA表達的影響

4 塞來昔布對SMMC-7721細胞COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達的影響 見圖3。Western blot結果顯示，實驗組與對照組比較COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；不同濃度塞來昔布組之間的差異也有統計學意義。

圖3 不同濃度塞來昔布對SMMC-7721細胞COX-2、VEGF和ERK1／2蛋白表達的影響

討 論

肝癌是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，但缺乏有效防治藥物。臨床肝癌化療藥物的有效率均不足20%，因此，尋找高效低毒的藥物成為肝癌治療的熱點。塞來昔布是近年來出現的特異性COX-2抑制劑，Harris等［2］發現其具有預防乳腺癌發生的作用。隨后的研究發現，塞來昔布對胃癌、結腸癌、膽管癌、白血病、膀胱癌等多種惡性腫瘤細胞均有抑制生長和促進凋亡的作用［3-4］。在腫瘤侵襲、轉移的過程中，MAPK信號通路起著重要作用，其中ERK1／2信號途徑具有重要地位。ERK1／2對腫瘤的作用主要體現在促進細胞增殖方面，活化的ERK激酶可作用于其他信號轉導途徑的關鍵效應分子，調節細胞周期相關因子和凋亡分子的表達，最終促進細胞增殖和向惡性轉化。Schuierer等［5］人研究發現肝癌細胞中ERK1／2活性較正常細胞明顯增強。

本實驗以既往相關文獻報道塞來昔布能夠抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡為依據，以塞來昔布能否抑制體外培養的SMMC-7721細胞增殖、誘導細胞凋亡為切入點，通過觀察塞來昔布對人肝癌SMMC-7721細胞增殖、凋亡及 COX-2、VEGF和 ERK1／2 mRNA和蛋白表達的影響，探討其可能機制。

本實驗通過不同濃度塞來昔布處理SMMC-7721細胞后發現，塞來昔布可抑制SMMC-7721細胞增殖，且呈時間和濃度依賴性。在此基礎上應用流式細胞儀檢測，發現不同濃度塞來昔布處理的SMMC-7721細胞出現了明顯的凋亡現象。這些結果與國內外的相關研究結果相一致［6-7］。

本實驗在觀察塞來昔布具有抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖、誘導細胞凋亡作用的同時，對其機制作了進一步的探討。目前，COX-2抑制劑誘導腫瘤細胞凋亡的途徑主要有兩個方面，即COX-2依賴性途徑和非COX-2依賴性途徑。COX-2依賴性途徑主要包括通過抑制COX-2減少前列腺素合成，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡［8-9］。非COX-2依賴性途徑抗腫瘤機制目前多家說法不一［10］。本實驗結果顯示，不同濃度的塞來昔布作用于SMMC-7721細胞后，其細胞中ERK1／2和VEGF的表達均明顯下調，且呈濃度依賴性，表明其作用機制可能與ERK1／2信號通路及抑制腫瘤新生血管形成有關。

綜上所述，本實驗證實了塞來昔布具有抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖及誘導凋亡的作用，為臨床上治療肝癌提供了新的思路。同時揭示塞來昔布抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖及誘導凋亡的作用機制除了與抑制COX-2的活性相關外，還可能與下調ERK1／2信號通路及抑制腫瘤新生血管形成有關，但具體分子機制仍需要進一步深入研究。

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