HbA1c和HbA0的分離純化

涂國華， 王碧筠， 朱云嬌， 秦 瑛， 姜旭淦

(1.無錫市濱湖區中醫院檢驗科，江蘇無錫214121;2.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013)

正常人主要血紅蛋白A包括與糖結合部分的HbA1和未結合糖部分的HbA0，其中HbA1包括HbA1a1、HbA1a2、HbA1b、HbA1c［1］。 HbA1c約 占HbA1的80%。國際臨床化學聯合會(IFCC)把HbA1c定義為Hb 1條或2條β鏈氨基末端與葡萄糖形成的穩定、不可逆的四聚體加成化合物(N-1-脫氧果糖基-Hb)［2］。其糖基化反應分2步:首先葡萄糖羰基與Hb的β鏈氨基末端纈氨酸的自由氨基縮合，生成不穩定醛亞胺即希夫式堿(Schiff base，前HbA1c)，此反應可逆;第2步醛亞胺經不可逆的Amadori重排形成穩定的酮胺［3］。

2010年美國糖尿病協會(ADA)首次將HbA1c≥6.5% 作為糖尿病診斷標準，HbA1c在5.7%～6.4%范圍內可認為是糖尿病高風險人群，并要求實驗室應采用經美國糖化血紅蛋白標準化計劃(NGSP)認可并符合糖尿病控制與并發癥試驗(DCCT)檢測標準的方法進行檢測［4］。HbA1c反映了過去2～3個月血糖平均控制水平［5］。

糖化血紅蛋白的免疫法測定是目前臨床常用方法之一，其原理是采用能識別糖化血紅蛋白β-鏈氨基末端幾個糖基化氨基酸的特異性抗體與HbA1c反應，形成抗原抗體復合物來進行檢測。該類方法快速、簡便，可在自動化儀器上檢測［6］。

在制備糖化血紅蛋白抗體和建立糖化血紅蛋白的免疫學測定方法時，需要獲得高純度的HbA1c和 HbA0組分。同時分離純化的 HbA1c和HbA0可用于制備糖化血紅蛋白檢測的校準品、標準品以及質控品。國內糖化血紅蛋白檢測均為各級實驗室自己建立的方法和參考區間，還未實行檢測的標準化。國際標準品制備方法［7］報道采用瓊脂糖親和層析分離糖化血紅蛋白及瑞典Mono S強酸陽離子交換樹脂純化。目前國內還缺乏HbA1c和HbA0分離和純化方面的報道。因Bio-Rex 70弱酸陽離子交換樹脂可商業獲得，我們參考該法，采用弱酸陽離子交換層析法和硼酸瓊脂糖親和層析法對健康人全血溶血液中的HbA1c和HbA0進行了分離和純化。

材料和方法

一、材料

高效液相色譜(HPLC)儀為Waters公司生產，檢測器為Waters 2487型，雙泵為515 pump;UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津);eppendorf-5417R高速離心機;垂直電泳儀(Rio-Rad公司);Biowave DNA型蛋白核酸分析儀(英國Biochrom公司);層析柱(16 mm×300 mm，10 mm×300 mm)購自江陰新輝層析設備有限公司;透析袋(MW:8000-14000)購自美國聯合碳化物公司。Bio-Rex 70弱酸陽離子交換樹脂(200～400目，Na+型)、硼酸瓊脂糖親和層析樹脂、氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)比色法試劑、聚乙二醇20000。

二、方法

1.臨床標本采集及溶血液的制備 收集鎮江市第一人民醫院經體檢各項指標正常的健康人全血，所有標本采用EDTA-K2抗凝。紅細胞溶血液按IFCC參考方法［8］中制備的要求進行。

2.弱酸陽離子交換層析法分離 HbA1c和HbA0的實驗條件 手工分離柱離子交換試劑A液為40 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值6.6)，B液為100 mmol/L NaCl(pH值6.4，含20 mmol/L PBS)，C 液為400 mmol/L NaCl。Bio-Rex 70樹脂的活化與裝柱過程參照文獻［9］。活化后的樹脂采用A液保存。將Bio-Rex 70弱酸陽離子交換樹脂攪拌均勻，裝入層析柱(16 mm×300 mm)中，填料上端覆蓋少量A液備用。新手工裝制備層析柱分離時溫度控制在22～25℃，選擇415 nm波長監測層析柱分離洗脫吸光度(A)值。A液洗脫HbA1a+HbA1b部分，B洗脫 HbA1c部分，收集 A值峰值部分;再加C液洗脫HbA0部分，收集A值峰值部分。收集的2個峰值部分分別裝入預處理的透析袋，聚乙二醇20000濃縮，并用蒸餾水4℃透析24h。采用HPLC-Bio-Rex 70鑒定純度［10］。

3.硼酸瓊脂糖親和層析法純化 HbA1c和HbA0的實驗條件 親和洗滌緩沖液(pH值8.0):0.25 mol/L 乙酸銨、50 mmol/L MgCl2、0.2 g/L NaN3;親和洗脫緩沖液(pH值8.5):0.2 mol/L山梨醇、0.1 mol/L Tris、0.2 g/L NaN3。取約 20 mL硼酸瓊脂糖親和層析樹脂，裝入層析柱(10 mm×300 mm)，防止產生氣泡，洗滌緩沖液平衡柱pH值至8.0即可使用。使用過的層析柱可用HCl再生后重復使用。按照每毫升親和層析樹脂加0.3 mg HbA1c或者 1.5 mg HbA0粗分離樣品。

4.HbA1c的純化 弱酸陽離子交換層析法分離HbA1c，應用硼酸瓊脂糖親和層析法純化，415 nm波長監測洗滌液A值，待A值不再下降后加洗脫緩沖液，收集A值峰值部分，4℃濃縮并透析24h。采用 HPLC-Bio-Rex 70 鑒定純度［9］并做十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳［11］。

5.HbA0純化 采用弱酸陽離子交換層析法分離HbA0，用親和洗滌緩沖液洗脫，415 nm波長監測親和洗滌液A值，收集A值峰值部分。4℃濃縮并透析。采用HPLC-Bio-Rex 70鑒定純度［10］并做 SDS-PAGE 電泳［11］。

結 果

一、將弱酸陽離子交換層析法獲得的HbA1c和HbA0組分用HPLC法檢測純度分別為79.78%和97.42%。見圖1。

二、用HPLC分別檢測經硼酸瓊酯糖親和層析法純化后的 HbA1c和 HbA0，其純度分別為94.53%和 99.73%。見圖2。

三、SDS-PAGE電泳顯示采用硼酸瓊脂糖親和層析法純化后的HbA1c和HbA0均為單一條帶。HbA1c和HbA0均為四聚體的四級結構，經變性后變成三級結構的亞基。電泳條帶位置位于相對分子質量14 000～25 000。見圖3。

圖1 HPLC對弱酸陽離子交換層析法HbA1c和HbA0的檢測結果

圖2 HPLC對硼酸瓊脂糖親和層析法純化后的HbA1c和HbA0檢測結果

圖3 經硼酸瓊脂糖親和層析法純化后HbA1c和HbA0的SDS-PAGE電泳結果

討 論

分離純化的糖化血紅蛋白可用于標準品的制備，HbA1c與HbA0還可按比率混合制備質控品、校準品，有利于各實驗室結果的比較及質量控制。同時，分離純化的糖化血紅蛋白可作為免疫抗原來制備單克隆、多克隆抗體，也可作為酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的包被抗原，來檢測抗體效價。純化的HbA0可用于篩選檢測糖化血紅蛋白的單克隆抗體是否有交叉反應，因為糖化血紅蛋白單克隆抗體應只識別HbA1c而不與HbA0反應。

弱酸陽離子交換層析法基于Hb各組分等電點不同，在弱酸性條件下所帶電荷數量存在差異，與離子交換樹脂的吸附和交換能力不同而分離。帶電荷較少的糖化血紅蛋白部分先洗脫，而電荷較多的非糖化血紅蛋白后洗脫。使用低離子強度的緩沖液即可洗脫HbA1，高離子強度的緩沖液即可洗脫非糖化血紅蛋白［12］。Bio-Rex 70陽離子交換樹脂使用不同離子強度和pH值的磷酸鹽緩沖液來洗脫可以分離的糖化血紅蛋白及其組分，為DCCT和NGSP參考方法所采用［13］。本研究中以Bio-Rex 70弱酸陽離子交換樹脂為填料，裝備了用于糖化血紅蛋白分離的制備柱，獲得了HbA1c和HbA0組分，用HPLC檢測HbA1c和HbA0的純度分別為79.78%和97.42%。本研究結果說明分離的HbA1c中含有少量HbA0，而分離的HbA0中含有少量 HbA1c。Goodall等［14］報道，Bio-Rex 70 弱酸陽離子交換樹脂分離的HbA1c峰值部分經親和樹脂層析僅僅65%～75%是糖基化部分，本研究結果與之相符。Bio-Rex 70弱酸陽離子交換樹脂檢測HbA1c純度最高能夠達到多少，有待于進一步采用IFCC參考方法［7］檢測并比較驗證。因IFCC參考方法條件的限制，并未采用此法測定純度。

硼酸瓊脂糖親和層析法是利用硼酸基團可與糖化血紅蛋白分子上葡萄糖的1，2－順位二元醇可逆結合而進行分離。這種順位二元醇結合是非特異的，所有順位二元醇結構的分子均可結合到氨基苯硼酸集團上。Goodall等［14］報道，與親和層析樹脂結合的糖基化部分通過比色法分析顯示含有10%的 HbA1a+HbA1b，52%的 HbA1c和38%的HbA0;親和層析非糖化部分經比色分析顯示主要為HbA1a+HbA1b和 HbA0，同時含有少量HbA1c。由此可見，硼酸瓊脂糖親和層析法用于HbA1c和HbA0分離的第1步，其效果將不如弱酸陽離子交換層析法。因此，本研究將其用于對HbA1c和HbA0粗制品的純化。研究結果表明，弱酸陽離子交換層析法分離的HbA1c和HbA0經硼酸瓊脂糖親和層析法純化后的純度分別為94.53%和99.73%。本研究結果提示單獨采用離子交換樹脂方法或者親和層析方法分離血紅蛋白組分效果并不理想，必須2種方法結合，才能獲得較好的分離效果。

致謝:本實驗得到了江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院姜旭淦老師的大力支持與幫助，在此表示衷心的感謝。

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