PPARγ 基因過表達/沉默對缺氧誘導的腎小管上皮細胞壞死性凋亡標志物表達調控作用

蹇淑娟，涂立，鄒家森，朱仕群，覃遠漢

廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西南寧530021

腎間質纖維化（RIF）被認為是慢性腎臟疾病發展為腎衰竭的最常見途徑，是各類腎臟疾病進展至終末期腎病的必然結果，目前其發病機制尚未完全明確。研究［1］提示，腎小管上皮細胞（RTEC）損傷可能是RIF 發生發展的關鍵因素和中心環節，其中缺氧為RTEC 損傷的重要原因之一，可導致壞死性凋亡的發生。壞死性凋亡是一種不依賴caspase 機制、兼有壞死和凋亡雙重特征的程序性壞死，它的發生主要取決于絲氨酸-蘇氨酸激酶3（RIPK3）的激活［2］。研究［3］顯示，RIPK1 在核心信號轉導級聯中也發揮了重要的作用。受體交互作用蛋白1（RIP1）和RIP3作為壞死性凋亡的上游分子信號，當壞死性凋亡啟動后，RIP1 發生泛素化、去泛素化、磷酸化等一系列反應；而當蛋白激酶8 被抑制時，RIP1 與RIP3 發生相互磷酸化，形成壞死性凋亡小體，從而介導壞死性凋亡的發生［4］。因此，RIP1、RIP3不僅是壞死性凋亡發生發展的關鍵信號，也是壞死性凋亡的標志性蛋白。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一類核轉錄因子，屬Ⅱ型核激素受體超家族成員，根據編碼基因的不同可分為三種細胞亞型，分別為PPARα、PPARβ 和PPARγ，其中PPARγ 參與了正常腎臟的發育、脂質代謝，具有調節水鹽重吸收和調控腎血流量并激活腎素血管緊張素系統等生理功能。研究［5］顯示，轉化生長因子-β（TGF-β）作為腎纖維化的靶點，它的激活使得腎小球的纖溶酶原激活物的活性顯著降低，導致腎小球系膜基質沉積。研究［6］發現，TGF-β 與 PPARγ 之間也存在一定的聯系，當RTEC 受到 TGF-β1攻擊時，PPARγ 的表達和活性顯著降低。我們前期研究［7］顯示，調控PPARγ 基因的表達可減輕RTEC 的損傷程度，調控方式包括添加PPARγ 激動劑和抑制劑，以及通過轉染慢病毒載體進行基因干擾［8］，從而改變PPARγ 的表達水平。然而，在缺氧誘導的RTEC損傷中，有關PPARγ基因表達與細胞壞死性凋亡的關系，目前國內外尚未見報道。2019 年 10 月-2020 年 9 月，我們通過建立 RTEC壞死性凋亡模型，利用基因干擾技術沉默內源性和轉染外源性 PPARγ 基因，觀察了 PPARγ 基因過表達/沉默對缺氧誘導的RTEC 壞死性凋亡標志物表達的調控作用，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養方法 大鼠RTEC 細胞株（NRK-52E）購于上海細胞庫，用含10%超濾胎牛血清和1%雙抗的高糖DEME 培養基放置于37 ℃、50 mL/L CO2培養箱中培養。

1.2 細胞分組、轉染及模型構建 將RTEC 細胞培養融合至80%左右時，將細胞培養瓶中的細胞消化為單個細胞，調整細胞密度傳入細胞培養瓶并隨機分為4組：對照組、缺氧損傷組、過表達組和沉默組。其中，過表達組細胞轉染過表達PPAYγ 基因的外源性LV-PPARg 病毒，沉默組細胞轉染沉默PPAYγ 基因的內源性LV-PPARg-RNAi 病毒。過表達組和沉默組的慢病毒載體均由上海吉凱基因公司構建，轉染后經熒光顯微鏡和PCR 驗證效果，轉染效率達80%以上。待細胞再次生長融合至70%左右時，正常對照組不做任何處理，放置于培養箱中培養；缺氧損傷組、過表達組以及沉默組放置于含95%N2和5%CO2混合氣體缺氧小室中，密封缺氧培養48 h。

1.3 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取各組細胞，TRIzol 法提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒要求的標準條件反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，以GAPDH 為內參，應用熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR。引物序列如下：GAPDH 上游引物為5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下 游 引 物 為 5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；PPARγ 上游引物為5′-GGAGCCTAAGTTTGAGTTTGCTGTG-3′，下游引物為 5′-TGCAGCAGGTTGTCTTGGATG-3′；RIP1上游引物為5′-CTTCTGCTCTCCTGGCTCATTGTG-3′，下游引物為5′-CGGTTGCTGATCTGGACGGTTG-3′；RIP3 上游引物為 5′-GGTGGTAGACAAGACCTCACTAATTCG-3′，下游引物為5′-ATGCGTCATTAACTCCTTCAGTCCTTC-3′；TGF-β 上游引物為 5′-ATGGTGGACCGCAACAACGC-3′，下游引物為 5′-CTGGCACTGCTTCCCGAATGTC-3′。建立 20.0 μL反應體系：2.5×Real MasterMix/SYBR solu-tion 9.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA 2 μL，超純水7.4 μL。RT-qPCR 反應條件：50 ℃預熱2 min，95 ℃激活10 min，95 ℃循環40次，每次15 s，60 ℃退火30 s。以2-ΔΔCt表示細胞中目的mRNA的相對表達量。

1.4 各組細胞中 PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β 蛋白檢測 采用Western blotting 法。取出缺氧小室中的各組細胞，放入常規培養箱中復氧1 h，然后按照免疫沉淀測定（RIPA）蛋白裂解液說明書分別提取各組的總蛋白，以二喹琳甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將提取的各組蛋白，在4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min 后分別吸取上清，按照 4：1 比例加入蛋白上樣緩沖液輕柔吹打混勻，100 ℃水浴5 min變性。以GAPDH 為內參，每孔樣本上樣量為18 μg，行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠泳（SDS-PAGE），電泳結束后按照不同蛋白分子量確定轉膜時間，采用濕轉法轉膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h 后，分別置于特異性一抗溶液中，4 ℃孵育16～18 h，后予以TBST溶液洗膜3次，每次10 min；再置于二抗溶液中室溫下孵育1.5 h，TBST 溶液洗膜3次，每次10 min。以發光液覆蓋PVDF 膜，掃描PVDF 顯影，應用Alpha View 軟件測定各蛋白的灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值來反映各組目的蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以表示，比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對表達量比較 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對表達量比較（）

表1 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β mRNA相對表達量比較（）

注：與正常對照組相比，*P＜0.05；與缺氧損傷組相比，#P＜0.05。

組別RIP1 mRNA RIP3 mRNA TGF-βmRNA對照組缺氧損傷組過表達組沉默組1.00±0.00 1.53±0.08*1.31±0.1*#1.79±0.13*#PPARγ mRNA 1.00±0.00 0.40±0.09*0.73±0.11*#0.14±0.06*#1.00±0.00 1.47±0.11*1.23±0.08*#1.78±0.09*#1.00±0.00 1.42±0.09*1.24±0.08*#1.62±0.08*#

2.2 各組細胞中 PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β 蛋白相對表達量比較 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β蛋白相對表達量比較見表2。

表2 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β蛋白相對表達量比較（）

表2 各組細胞中PPARγ、RIP1、RIP3、TGF-β蛋白相對表達量比較（）

注：與正常對照組相比，*P＜0.05；與缺氧損傷組相比，#P＜0.05。

組別對照組缺氧損傷組過表達組沉默組TGF-β蛋白0.46±0.11 0.97±0.14*0.69±0.08*#1.26±0.15*#PPARγ蛋白1.03±0.02 0.49±0.02*0.74±0.03*#0.26±0.01*#RIP1蛋白0.47±0.05 0.97±0.04*0.67±0.03*#1.22±0.03*#RIP3蛋白0.35±0.07 1.01±0.09*0.64±0.11*#1.24±0.08*#

3 討論

RIF 是各類腎臟疾病進展至終末期腎病的必然途徑和顯著病理表現，其發生機制尚未完全明確，目前認為RTEC 損傷與RIF 的發生發展密切相關。研究［4］發現，在缺氧誘導的 RTEC 損傷中，激動劑羅格列酮可上調PPARγ 的蛋白表達而減輕RTEC 的損傷。在大鼠膿毒癥模型中，激活PPARγ 可預防敗血癥大鼠的壞死和凋亡，保護心肌免受膿毒癥所致損傷［9］。黃酮類非瑟酮通過調節 PPARγ 以減輕炎癥和細胞凋亡，抑制基于MAPK 的分子機制從而保護心臟［10］。以上研究結果提示，PPARγ 的表達改變與壞死性凋亡關系密切。不僅如此，PPARγ 在調節腎臟生理功能中起重要作用［11］，如PPARγ 基因突變可導致不正常的脂質和糖代謝、胰島素抵抗，從而發展成肥胖引起的 2 型糖尿病［12～13］；敲除 PPARγ 基因的小鼠出現腎功能不全，肌酐清除率降低，伴有纖維化和腎小管擴張［14］；羅格列酮作為配體激活PPARγ，減輕了膿毒癥時的炎癥反應，減少腎臟細胞凋亡，改善了腎臟功能，對大鼠膿毒癥急性腎損傷具有保護作用［15］。

凋亡和壞死是細胞死亡的兩種病理類型。凋亡是程序控制的細胞死亡，在發育過程中和生理細胞更新過程中受到嚴格控制；壞死發生在創傷中，主要以不受控制的方式發生［16］。而壞死性凋亡是一種具有壞死特征的新型細胞死亡模式，在形態學上以細胞器腫脹和細胞膜破裂為特征，同時又是一種可調控的不依賴caspase 的非免疫細胞程序性細胞死亡，其中，RIP1、RIP3 是該途徑的關鍵參與者［17～18］。RIPK3 的激活，對caspase-8 分子的抑制將外源性凋亡轉變為細胞死亡的壞死模式；RIPK1 則抑制細胞凋亡和壞死的通過激酶獨立的功能，對預防炎癥有重要作用［19～20］。壞死性凋亡作為一種重要的細胞死亡模式，它的發生發展及阻斷機制是一個復雜的過程，于腎臟而言，抑制腎臟細胞的壞死性凋亡可以減輕藥物誘導的細胞毒性以及炎癥反應的表達，對腎臟起到了一定的保護作用［21］。

上述研究提示，PPARγ 的表達水平和RTEC 壞死性凋亡均有可能參與了腎臟疾病的發生發展。PPARγ 作為參與調節腎臟許多重要生理功能的核轉錄因子，當腎臟受損時可能也會引起其表達水平的變化。而RIP1、RIP3作為壞死性凋亡的特異性蛋白，TGF-β 作為腎纖維化介導因子，它們與PPARγ之間是否存在聯系？PPARγ 表達水平的改變是否會影響RTEC 壞死性凋亡？為了探討這個問題，本研究通過建立缺氧誘導RTEC 壞死性凋亡模型，利用慢病毒沉默內源性和轉染外源性PPARγ 基因，調控其在RTEC 中的表達水平，結果顯示，與缺氧損傷組比較，過表達組細胞中PPARγ 的mRNA 及其蛋白表達量均顯著增高，沉默組細胞中PPARγ 的mRNA及其蛋白表達量均顯著降低；過表達組細胞中RIP1、RIP3、TGF-β的mRNA及其蛋白表達量均顯著降低，而沉默組細胞中RIP1、RIP3、TGF-β 的mRNA及其蛋白表達量均顯著增高，提示上調PPARγ 的基因表達可以減輕缺氧所致的RTEC 壞死性凋亡，而下調PPARγ的基因表達則加重RTEC壞死性凋亡。

綜上所述，在缺氧誘導的RTEC 壞死性凋亡中，PPARγ基因表達降低；過表達PPARγ基因對缺氧誘導的RTEC 壞死性凋亡有抑制作用，而沉默PPARγ基因則有促進作用。