清利活血湯配合三黃生肌紗條對糖尿病潰瘍大鼠肉芽組織中白介素1、內皮素1及堿性成纖維細胞生長因子含量的影響

段旭東 張雅蘭 趙 輝 高 璇 王曉媛 (河北醫科大學第二醫院中醫外科，河北 石家莊 050000)

糖尿病足(DF)是糖尿病患者主要的慢性合并疾病之一，其病程長、治療難度大、花費高昂，目前普遍認為DF是一個全身性疾病，它既有內科疾病的臨床表現，又有肢端潰爛，局部感染等外科疾病的癥狀和體征，所以在其治療上，要重視內外科綜合治療〔1〕。我科采用清利活血湯配合三黃生肌紗條治療糖尿病足多年，取得了良好的臨床療效。為探討其作用機制，本實驗復制了DF動物模型，并初步觀察了二者對糖尿病潰瘍大鼠肉芽組織中白介素1(IL-1)、內皮素1(ET-1)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠32只，全部雄性，體重180～220 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:1103043，室溫20℃飼養，自由進食水。

1.2 藥物

1.2.1 清利活血湯 黃芪20 g，山藥15 g，當歸12 g，桃仁9 g，紅花 9 g，川芎 9 g，山楂 6 g，生地 9 g，玄參 20 g，蒼術 9 g，銀花12 g，黃連 6 g，土元 6 g，魚腥草 15 g，上藥加水 1 000 ml，浸泡2 h，武火煮開，文火煎煮15 min，將藥液倒出，加水500 ml，煎煮15 min，將藥液倒出與第一次藥液混合，使用前分別濃縮成含2.42 g生藥/ml的混懸液。冷藏保存。三黃生肌紗條:黃連、黃柏、姜黃、當歸各15 g，生地30 g等，麻油500 g浸藥3 d，微火煎熬至藥枯，去藥渣后加入黃蠟30 g，微火化開，浸入滅菌紗布條，低溫儲存待用。

1.2.2 鹽酸二甲雙胍片 北京中惠藥業有限公司產品，批準文號:國藥準字 H19983069，批號20101112，0.25 g/片。

1.3 主要儀器及試劑 高壓液相分析，VARIANT-2美國伯樂公司產品。酶聯免疫檢測儀，MK3，芬蘭雷勃公司產品。全自動洗板機8×12，美國寶特公司產品。電熱恒溫水箱，600型，天津泰斯特公司產品。離心機，TDL-5-A，上海安亭科學儀器廠產品。循環水真空泵，SHB-D，鄭州長城科工貿有限公司產品。γ-放射免疫計數器，FJ-2021，西安二六二廠，電動玻璃勻漿機DY89-1寧波新芝生物科技股份有限公司。立式低溫冷藏箱，DW-40L262青島海爾醫用低溫科技有限公司。高性能無菌實驗臺，DL-CJ-1N哈爾濱東聯電子技術開發有限公司產品。電子天平HM-200日本。bFGF酶聯免疫組化染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司產品。鏈脲佐菌素(STZ)，sigma公司產品，批號S-0130。IL-1、ET-1放免試劑盒，北京301醫院放免所產品，批號20110525。

1.4 動物分組及用藥 Wistar大鼠適應性飼養1 w后隨機分為DF模型組、正常組、清利活血湯治療組(治療組)、二甲雙胍治療對照組(對照組)，每組8只。治療組及對照組均從模型建立后第1天開始灌胃給藥2 ml，每日1次，共用藥15 d，用藥劑量按有關公式，將成人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量，模型組、正常組均以2 ml生理鹽水替代藥物每日1次灌胃，共15 d。各組大鼠均從手術后第1天起，每日清創1次，祛除創面上硬痂，常規消毒，用生理鹽水沖洗創面。治療組以三黃生肌紗條外敷，對照組用凡士林紗條外敷，正常組、模型組以生理鹽水紗條外敷。創面外用無菌紗布包扎，膠布固定。

1.5 模型建立 32只雄性Wistar大鼠隨機分為4組，每組8只，隨機抽取1組為正常對照組，普通飼料喂養，余組高脂飼料喂養，4 w后禁食(不禁水)16 h，一次性腹腔注射低劑量STZ 30 mg/kg(用pH4.4的無菌枸櫞酸緩沖液配成0.25%濃度);正常對照組腹腔注射等體積的0.1 mol/L無菌枸櫞酸緩沖液，72 h后斷尾取血，測定血糖，血糖＞16.65 mmol/L者成為成模大鼠，隨機選取糖尿病大鼠按照血糖隨機分為糖尿病模型組、治療組、對照組。每組8只。4組動物在空腹8 h后均以10%水合氯醛1 ml/100 g體重腹腔注射麻醉，背部剃毛，常規消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左側相同部位打孔(φ2 cm)，潰瘍深及筋膜層，止血后以無菌紗布包扎，分籠飼養，自由飲水與進食，用藥期間所有糖尿病大鼠繼續以普通飼料喂養。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 糖化血紅蛋白(HbA1c)測定 10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔內注射麻醉后，切斷大鼠右股動脈取血，置EDTA抗凝管內，采用高壓液相法測定。

1.6.2 IL-1、ET-1的測定 采用放射免疫法，分別取肉芽組織2 g生理鹽水沖洗3次，剪碎后移入高速勻漿器中，加入4℃生理鹽水4 ml，高速研磨2 min，使組織充分勻漿，制備好的勻漿置離心機3 000 r/min離心15 min，提取上清液備用，測定時將樣品稀釋，取組織勻漿0.1 ml，先由自動γ-放射免疫計數器預先編制程序，直接給出標準曲線及濃度，然后測定IL-1、ET-1含量，并同時測得勻漿上清蛋白含量(g)進行校正。

1.6.3 bFGF測定 采用免疫組化法半定量測定，石蠟切片常規脫蠟，微波抗原修復，加 3%H2O2去離子水 3 ml，孵育5～10 min，以消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，3 min×3次，滴加封閉用正常山羊血清工作液3 ml，室溫孵育10～15 min，傾去，滴加適當比例稀釋的一抗，4℃過夜，PBS沖洗3 min×3次，滴加生物素標記山羊抗大鼠IgG，37℃孵育10～15 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加辣根標記鏈霉卵蛋白工作液3 ml，37℃孵育10～15 min，顯色劑顯色，沖洗，封片。計算機圖像處理軟件半定量測定bFGF含量，以染色吸光度值表示。

2 結果

2.1 大鼠創面肉芽組織bFGF含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠肉芽組織中bFGF含量明顯增高(P＜0.01)，與模型組比較，治療組及對照組bFGF均較模型組明顯降低(P＜0.01)，治療組bFGF較對照組低(P＜0.05)。見表1及圖1。

2.2 大鼠創面肉芽組織ET-1含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠肉芽組織中ET-1含量明顯增高(P＜0.01)，與模型組比較，治療組及對照組ET-1均較模型組明顯降低(P＜0.01)，治療組ET-1較對照組低(P＜0.05)。見表1。

2.3 大鼠創面肉芽組織IL-1含量的變化 與正常組比較，模型組大鼠肉芽組織中IL-1含量明顯增高(P＜0.01)，與模型組比較，治療組及對照組IL-1均較模型組明顯降低(P＜0.01)，治療組ET-1較對照組低(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠創面肉芽組織bFGF表達(×400)

2.4 大鼠HbA1c的變化 與正常組比較，模型組大鼠HbA1c明顯增高〔(18.15±1.86)%vs(6.48±1.28)%，P＜0.01〕，與模型組比較，治療組及對照組HbA1c均較模型組明顯降低〔(12.88±2.77)%，(15.01±1.64)%，P ＜0.01〕，治療組HbA1c較對照組低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠ET-1、IL-1、bFGF含量( s，n=8)

表1 各組大鼠ET-1、IL-1、bFGF含量( s，n=8)

與模型組相比:1)P＜0.01;與對照組相比:2)P＜0.01，3)P＜0.05

正常組 － 10.50±1.661)2)16.74±3.271)2)0.536±0.1271)2)模型組 － 19.81±1.89 50.97±7.45 0.202±0.042治療組 14.5 g/kg 13.80±1.1813)28.34±4.4813)0.421±0.0541)3)對照組 75 mg/kg 16.02±0.911)38.13±7.571 0.290±0.038

3 討論

DF是糖尿病的嚴重并發癥，是糖尿病患者致死、致殘的重要原因之一，不僅嚴重影響著糖尿病病人的壽命和生質量，也給家庭、社會和國家帶來了沉重的經濟負擔。研究發現，在DF潰瘍中，生長因子和其他傷口愈合所需要的介質發生異常〔2，3〕，從而影響了傷口愈合。因此深入研究這些因子在DF潰瘍中的變化及作用，有助于揭示潰瘍難以愈合的機制，并為臨床治療提供新的思路。

IL-1是典型的致炎細胞因子，幾乎各種有核細胞均能產生，但不同的情況，不同的細胞，不同的濃度，IL-1的作用可能不同，甚至完全相反。在創傷后的急性炎癥期，IL-1發揮著重要的作用，在傷后的第3～5天IL-1處于低水平，第8天達到高峰，肖正華等〔4〕的研究表明糖尿病足難治潰瘍面上IL-1顯著增高，進而抑制了成纖維細胞的增殖，從而使潰瘍難以愈合。而降低潰瘍面上IL-1含量，可加速創面愈合。

ET-1是一種21個氨基酸組成的多肽，是目前所知道的作用最強的血管收縮劑，其在糖尿病下肢壞疽的發生及預后中起著重要的作用。研究表明，血管內皮功能的改變是糖尿病血管并發癥的始發因素，高血糖狀態會損傷血管內皮細胞引起大量的ET釋放〔5〕，從而使局部血管處于持續收縮狀態，刺激血管平滑肌細胞增生，血小板凝聚，單核細胞變成泡沫細胞，形成粥樣斑塊，繼發血栓，出現相應的肢體缺血表現。降低血漿中ET-1含量可加速創面愈合〔6〕，而對糖尿病足潰瘍面組織中ET-1含量的情況尚未見報道。本研究顯示大鼠糖尿病潰瘍面中ET-1含量明顯高于非糖尿病組，其潰瘍面愈合亦較慢，而經治療后ET-1含量下降，其潰瘍面愈合較快，提示潰瘍面高濃度ET-1阻礙肉芽生長、潰瘍面愈合。

bFGF是一種多功能細胞生長因子，具有很廣泛的生物活性，能刺激來源于中胚層和神經外胚層細胞的生長，如成纖維細胞、血管內皮細胞、上皮細胞等，在創面形成后的正常修復中起著重要的作用。近年來研究發現，由于潰瘍創面的糖含量升高，使得晚期糖基化終末產物(AGEs)大量蓄積，一方面高糖狀態可使FGF發生糖基化從而喪失其活性，另一方面糖基化的生長因子可以與修復細胞表面糖基化產物受體RAGE結合，進而導致糖尿病局部創面遲發但持續的慢性炎癥，并改變修復細胞的合成分泌功能及增殖活性，導致潰瘍面難以愈合〔7，8〕。

DF潰瘍屬中醫“潰瘍”、“脫疽”、“消渴”等范疇，中醫學認為本病的發病機制主要是消渴日久，氣陰兩虛，經脈瘀阻，血行不暢，肢端失養，加之濕熱下注，久之則肢端壞死。故治療上應采用益氣養陰，活血通絡清熱利濕的治療方法，清利活血湯中黃芪、山藥、生地益氣養陰，當歸桃仁、紅花川芎養血活血，玄參、蒼術、銀花、黃連、土元、魚腥草清熱利濕，土鱉蟲咸寒歸肝經，有破瘀血、續筋骨功效，現代研究表明土鱉蟲具有較好的降血糖、血脂作用〔9〕;三黃生肌紗條在我科臨床應用多年，具有良好的清熱活血生肌斂瘡的作用，實驗研究其可以提高局部創面血管內皮生長因子的作用〔10〕。內外相和，清利活血生肌斂瘡，可較好地加速DF潰瘍面的愈合。

1 梁麗榮，譚 巖，趙維彥，等.糖尿病足的病因分析及治療進展〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(2):381-3.

2 肖正華，張正軍，周 倩，等.糖尿病足潰瘍患者白介素-1β對成纖維細胞增殖及基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9的影響〔J〕.中國慢性病預防與控制，2008;16(6):581-3.

3 Dinh TL，Veves A.A review of the mechanisms implicated in the pathogenesis of the diabetic foot〔J〕.Int J Low Extrem Wounds，2005;4(1):154-9.

4 肖正華，周 倩，余綺珍，等.糖尿病足潰瘍滲出液中IL-1β動態變化及黃芪提取液外敷治療〔J〕.廣州醫學院學報，2008;36(6):11-4.

5 王 靜，張秀娟，張秀敏.老年糖尿病血漿降鈣素基因相關肽和內皮素測定的臨床意義〔J〕.中國老年學雜志，2001;21(6):431.

6 李令根，李日恒，趙 鋼，等.康脈3號膠囊對糖尿病足患者內皮素及一氧化氮的影響〔J〕.中國中西醫結合外科雜志，2003;9(6):426-7.

7 Niu Y，Xie T，Ge K，et al.Effects of extracellular matrix glycosylation on proliferation and apoptosis of human dermal fibroblasts via the receptor for advanced glycosylated end products〔J〕.Am J Dermatopathol，2008;30(4):344-51.

8 Lohwasser C，Neureiter D，Weigle B，et al.The receptor for advanced glycation end products is highly expressed in the skin and upregulated by advanced glycation end products and tumor necrosis factor-alpha〔J〕.J Invest Dermatol，2006;126(2):291-9.

9 張 晶，許貴香.土鱉蟲對2型糖尿病大鼠模型血糖、血脂的影響〔J〕.第四軍醫大學學報，2009;30(5):465-7.

10 王曉媛，張雅蘭，王自輝，等.中西醫治療對糖尿病足局部組織中細胞因子表達的影響〔J〕.四川中醫，2010;28(12):93-5.