新型脫水穿心蓮內酯環磷酸酯類衍生物的合成及其抗腫瘤活性*

呂巧莉， 涂國剛， 詹建鋒， 王嘉琦， 李少華

(南昌大學 醫學院 藥學系，江西 南昌 330006)

有機磷化合物是一類生命過程中極其重要的物質，許多內源活性物質都含有磷酸酯結構單元，他們參與了能量轉化、物質代謝、遺傳表達等幾乎所有的生命過程[1]。在過去的研究中，有機磷藥物作為抗腫瘤藥有重大發現并應用于臨床，如廣譜抗腫瘤藥環磷酰胺、異環磷酰胺、甘磷酰氮芥、阿替哌、碘替哌、噻替哌、氯磷酰胺，膦西洛普利及雙二甲磷酰胺乙酯等等。文獻[2～4]報道，穿心蓮內酯衍生物大多具有良好的生物活性。因其具有內酯環及1，3-二醇的結構，其衍生物具有抑制腫瘤細胞生長及抗HIV活性[5～7]。

本文以穿心蓮內酯(2)為先導化合物，對其3-位和19-位進行結構修飾，設計并合成了3個新型的脫水穿心蓮內酯環磷酸酯類衍生物(1a～1c， Scheme 1)，其結構經1HNMR， IR和MS表征。初步的體外抗腫瘤活性測試結果表明，1a～1c對舌癌Tca-8113細胞具有較好的體外抑制活性。

本文通過在2的3-位和19-位引入環磷酸酯與環磷酰胺結構，有利于提高藥物的脂溶性，從而可望提高藥物的選擇性，降低其毒性。通過測定1a～1c的生物活性，并研究其對母體生物活性的影響，為進一步設計合成該類化合物提供實驗依據,以期發現新型、 高效低毒、有應用前景的抗腫瘤藥物。

CopmabcR21232527-O212325-ON2122Cl2324Cl-

Scheme1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BRUKER ADVANCE 600 M型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內標)；Perkin Elmer Spe 1645, 1595, FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片);ZQ-4000/2695型質譜儀。

磷酰二氯氮芥(3c)參考文獻[8]方法合成；其余所用試劑均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；舌癌Tca-8113細胞，武漢大學細胞典藏中心。

1.2 合成

(1)1a和1b的合成

在反應瓶中加入PClO316 mL(0.18 mol)，攪拌下分3次加入1-萘酚865 g(60 mmol)，加畢，加入氯化鈉1 g，緩慢加熱至回流，反應24 h(直至無HCl氣體放出)。于160 ℃蒸出過量的三氯氧磷得淡黃色油狀液體二氯磷酸酯3a。

在反應瓶中加入26.3 g(18 mmol)和無水吡啶30 mL,攪拌使其溶解;冰浴冷卻，攪拌下緩慢滴加3a156 g(60 mmol)的二氯甲烷(19.17 mL)溶液,滴畢，反應1 h；于室溫反應3 h。過濾，濾液減壓蒸干得油狀液體，用氯仿溶解，依次用稀鹽酸(2×40 mL)和水(3×50 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑得黃色固體，經硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶2]純化得淡黃色固體脫水穿心蓮內酯-3,19-環磷酸-1-萘酯(1a)。

用苯酚替代1-萘酚，用類似的方法合成3b和淡黃色固體脫水穿心蓮內酯-3,19-環磷酸苯酯(1b)。

1a： 產率83.7%；1H NMRδ： 0.83(s, 3H， 20-H), 1.34(m, 1H， 5-H), 1.34～1.82(m, 2H， 6-H), 1.36～1.70(m, 2H， 1-H), 1.47(s, 3H， 18-H), 2.05～2.29(m, 2H， 2-H), 2.12～2.44(m, 2H， 7-H), 2.29(m, 1H， 9-H), 3.94～4.04(m, 2H， 19-H), 4.18(m, 1H， 3-H), 4.50～4.73(brs, 2H， 17-H)， 4.89(d,J=5.4 Hz, 2H， 15-H), 6.07(d,J=13.4 Hz, 1H， 12-H), 6.64(m, 1H， 27-H)， 6.81(dd, 1H， 11-H), 7.12(br s, 1H， 26-H), 7.37(m, 1H， 22-H), 7.37(m, 1H， 23-H), 7.37(m, 1H， 25-H), 7.50(t, 1H， 14-H)， 7.62(d,J=7.8 Hz, 1H， 24-H), 8.10(d,J=7.8 Hz, 1H， 21-H)； IRν: 3 066, 2 495, 2 852, 2 360, 1 762, 1 645, 1 596, 1 573, 1 463, 1 448, 1 392, 1 290, 1 259 cm-1; MSm/z： 520.89[M+H+]。

1b： 產率80.9%；1H NMRδ: 0.9(d,J=6.6 Hz, 3H， 20-H)， 1.30～1.73(m, 2H， 1-H), 1.30(m, 1H， 5-H)， 1.30～1.84(m， 2H， 6-H), 1.45(s, 3H， 18-H), 2.14～2.48(m, 2H， 2-H), 2.14～2.64(m, 2H， 7-H), 2.29(m, 2H， 9-H), 3.87～4.04(m, 2H， 19-H)， 4.17(m, 1H， 3-H)， 4.58～4.80(brs, 2H， 17-H)， 4.92(dd,J=2.4 Hz, 11.4 Hz， 2H， 15-H)， 6.86(dt,J=10.2 Hz, 14.4 Hz， 1H， 12-H), 7.17(m, 1H， 22-H), 7.17(m, 1H， 26-H)， 7.22(m, 1H， 25-H), 7.33(m, 1H， 14-H), 7.33(m, 1H， 24-H)； IRν： 3 076, 2 945, 2 854, 2 341, 1 755, 1 643, 1 589, 1 489, 1 456, 1 398, 1 296, 1 188, 1 163 cm-1； MSm/z： 471.11[M+H+]。

(2)1c的合成

在反應瓶中加入3c4 g(15 mmol)和二氯甲烷5 mL,攪拌使其溶解；冰水浴冷卻下緩慢滴加2 1.63 g(4.65 mmol)的混合液(先用吡啶4 mL熱溶，再加二氯甲烷5 mL稀釋),滴畢，反應30 min；于室溫反應8 h,靜置過夜。過濾，濾餅用二氯甲烷(2×10 mL)洗滌，合并濾液和洗液，減壓蒸除溶劑得油狀液體，用三氯甲烷溶解后，用水(3×40 mL)萃取，有機層用無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑得淡黃色固體脫水穿心蓮內酯-3,19-環磷酰(二氯二乙基)胺(1c),產率84.7%；1H NMRδ: 0.92(d,J=6.6 Hz, 3H， 20-H), 1.27(m, 1H， 3-H), 1.30(m, 1H， 5-H)， 1.30～1.60(m, 2H， 1-H), 1.30～1.83(m, 2H， 6-H), 1.36(s, 3H， 18-H), 2.02～2.32(m, 2H， 2-H), 2.32(m, 1H， 9-H), 2.41～2.49(m, 2H， 7-H), 3.44(m, 2H， 21-H), 3.44(m, 2H， 23-H)， 3.61(m, 2H， 22-H), 3.61(m, 2H， 24-H)， 3.97(t,J=4.0 Hz 2H， 19-H)， 4.58～4.82(brs, 2H， 17-H), 4.90(dd,J=10.2 Hz, 1H， 15-H), 6.14(dd,J=4.2 Hz, 14.2Hz, 1H， 11-H), 6.86(m, 1H， 12-H), 7.48(dd,J=6.2 Hz, 7.2 Hz, 1H， 14-H)； IRν： 3 433, 2 943, 2 854, 2 503, 2 360, 1 757, 1 714, 1 627, 1 458, 1 396,1 298, 1 085, 983, 935 cm-1； MSm/z: 518.11[M+H+]。

2 結果與討論

2.1 合成

到目前為止，僅有一篇文獻[9]報道過脫水穿心蓮內酯環磷酸酯的合成，其采用的合成方法是：將2，三氯氧磷，吡啶和二氯甲烷反應，首先制成脫水穿心蓮內酯-3,19-環磷酰氯，然再與乙醇反應，加入少量DMAP與吡啶作為催化劑與縛酸劑，最終制得脫水穿心蓮內酯環磷酸乙酯。由于空間位阻的影響，該方法不適用于大分子伯醇、仲醇與伯胺、仲胺等。

本文對文獻[9]方法進行工藝改進，首先將各種含羥基的化合物(包括伯醇、仲醇、酚類)及含氮(伯胺、仲胺)化合物與三氯氧磷反應，由于三氯氧磷活性較高，可較易制得二氯磷酸酯(3)； 3再與2的3-位和19-位羥基反應，可以較高產率生成脫水穿內酯-3,19-環磷酸酯類與環磷酰胺類化合物。

在3的合成中，我們曾嘗試了更緩和的反應條件[10]，但是由于涉及到的試劑與操作步驟多，易引入水，使生成的產物又分解，降低產率，影響測試結果。為此采用直接將酚，NaCl和三氯氧磷進行回流反應制備3。

在1的合成中，除反應過程需絕對的無水操作外，還應注意由于反應過程中3的活性極高，而2本身具有五元內酯環，結構不穩定，當遇到強酸或強堿時或反應時間延長，均可使之開環，大大降低產率，且不易分離純化，所以需要緩和的反應條件，在此反應過程中所有試劑均需進行除水，溫度控制在-5 ℃～-15 ℃，反應時間控制在冰鹽浴1 h,常溫3 h。

2.2 生物活性測試及結果

取舌癌Tca-8113細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于37 ℃， 100%濕度，5%CO2培養箱中培養并進行傳代。后取于對數生長期細胞按5 000個/孔接種于96孔的培養板，加入1，使最終濃度分別為1.0×10-4mol·L-1(A), (1/2)×1.0×10-4mol·L-1(B)和(1/2)2×1.0×10-4mol·L-1(C)。每組6個平行復孔，并以單純細胞組作為空白對照，置于培養箱孵育24 h。待96孔板中加藥各組細胞的藥物作用24 h后，在每孔細胞中加入20 μL新鮮配制的0.5%MTT試劑，置于培養箱繼續避光作用4 h～5 h后，小心棄去孔內培養液。于各孔中加入DMSO 150 μL，避光振蕩15 min，使結晶物溶解充分。設定570 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收度并計算細胞抑制率，結果見表1。

表 1 1對舌癌細胞的抑制率*Table 1 Inhibition rate of 1 on Tca-8113

*A=1.0×10-4， B= (1/2)×1.0×10-4， C=(1/2)2×1.0×10-4

由表1可見，1a～1c均具有抗腫瘤活性，其中1c的抗癌效果最好。

3 結論

本文合成了3個新型的脫水穿心蓮內酯環磷酸酯類與環磷酰胺衍生物。該方法新穎，原料易得，成本低，過量三氯氧磷可回收利用，無三廢。

3個化合物對舌癌細胞有不同的抑制率，可為進一步以穿心蓮內酯為先導化合物開發出更高效低毒的環磷酸酯類與環磷酰胺類抗腫瘤新藥奠定基礎。

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