江蘇啤酒大麥制麥過程中細菌群落結構分析*

王璐，梁小剛，陸健

1(無錫中糧工程科技有限公司，江蘇無錫，214035)

2(江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

我國啤酒產量已連續十多年位居世界之首，啤酒行業對啤酒生產原料的需求還會持續增加［1］。啤酒大麥是啤酒生產的主要原料之一，大麥中復雜的微生物群落(革蘭氏陰性、陽性細菌，酵母和絲狀真菌)對麥芽制造及啤酒釀造有著非常重要的影響［2］。江蘇啤酒大麥在國產啤酒大麥中占有重要的位置，但其收獲季節頻遇雨季，容易受到各種微生物的侵染，致使麥芽品質有不同程度的下降，甚至影響到啤酒的釀造［3］。真菌微生物能產生各類真菌毒素、啤酒酵母提前絮凝因子等［2，4］，國內已經關注啤酒大麥中的真菌群落結構及其對麥芽品質造成的影響［5－7］。由于江蘇地理環境與氣候等因素的影響，細菌在江蘇啤酒大麥中存在的種類與數量很多，對麥芽釀造品質的影響(麥汁過濾速度緩慢、導致啤酒風味改變等)也很突出［2，8－9］，因此，有必要詳細了解江蘇啤酒大麥制麥過程中的細菌群落結構，為進一步研究其對麥芽釀造品質的影響提供依據。

啤酒大麥微生物群落中細菌的數量最多，有研究稱一個單一的大麥麥粒上面附著著約50萬個細菌，如此多的細菌勢必會對制麥過程及麥芽品質造成影響［10］。如想更加清楚地了解江蘇啤酒大麥制麥過程中的細菌群落結構，需要選擇合理的檢測手段。而傳統分離培養的方法存在一些弊端，需針對不同細菌種類設計不同的培養基，且需要較長的培養時間，耗費大量的人力物力等［11］。聚合酶鏈式反應－變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術在微生物群落結構的分析方面已得到廣泛的應用［5］，但國內尚未有利用PCR－DGGE分析江蘇啤酒大麥制麥過程中細菌群落結構的報道。將傳統分離培養方法與PCR-DGGE技術相結合，會使分析結果更加準確、全面［12］。

本文利用傳統平板計數結合PCR-DGGE技術，對江蘇目前的主要品種(單二)啤酒大麥制麥過程中的細菌群落進行了較為詳細的分析，旨在了解江蘇啤酒大麥制麥過程中細菌群落結構，為進一步了解細菌對江蘇啤酒大麥麥芽品質的影響打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

江蘇單二啤酒大麥，在江蘇某麥芽企業生產現場(塔式制麥)取樣，每個樣品都隨機取樣3次(即在3批次投料過程中分別取樣)。制麥工藝如下:錐底浸麥:浸麥水溫度14～15℃，濕浸6.5 h，干浸7.5 h;平底浸麥:水溫14～15℃，濕浸6.5 h，干浸7.5 h，浸麥度達到41% ～42%;發芽:溫度15～16℃，水分含量44% ～46%，時間85～90 h;排潮:溫度從57℃逐漸上升至65℃，時間15～16 h;焙焦:溫度從75℃逐漸升至83℃(85℃)，時間6～7 h，維持83℃(85℃)3 h。

1.1.2 主要試劑

Fast DNA○RSpin Kit For Soil，購自美國 MP Bio-medicals公司;去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素，均購自上海生工生物工程有限公司;Wizard○RGenomic DNA Purification Kit，購自 Promega;PCR所用試劑、DNA Marker、pMD18-T Vector試劑盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit，均購自 TaKaRa公司;Gold view，賽百盛生物工程有限公司;SYBR GreenⅠ，北京優尼康生物科技有限公司;其余試劑購自國藥集團化學試劑公司，均為分析純。PCR擴增所用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設備

DCodeTMUniversal Mutation Detection System、Gel Doc XR凝膠成像系統:BioRad公司，USA;Mastercycler nexus gradient梯度PCR儀:德國Eppendorf公司;FastPrep○R快速核酸提取儀(FP120)，美國 MPbio 公司;Gene Quant核酸蛋白定量儀GZNQVA，Biochrom，UK。

1.1.4 培養基

Luria-Bertani(LB)培養基，LB選擇性培養基，Nutrient Aagar(NA)培養基，MRS培養基等配方，參照文獻［13］。

傳統新聞報道主要以專業、權威的報道敘述為主，為了適應新媒體語境，各報業機構開辦的官方微博、微信增強了親近性表達方式。例如，人民日報海外版微信公眾號“俠客島”將“島叔”形象貫穿文本，通過將官媒人格化的方式拉近與用戶之間的距離。從報業機構自身來看，其改變了以往高高在上的刻板印象，以更具人性化的形象擴大自身的影響力。而從用戶角度來看，增強了其與媒體及其他用戶的互動交流，也主動掌握了在新聞事件中的話語權。

1.2 實驗方法

1.2.1 傳統平板計數

詳細步驟參照文獻［14］。

1.2.2 啤酒大麥、麥芽總DNA的提取

稱取0.1 g粉碎后的樣品，用Fast DNA○RSpin Kit For Soil試劑盒進行樣品總DNA提取，提取步驟參照說明書，得到的粗DNA進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗證后存于－20℃備用。

1.2.3 PCR擴增

研究中采用嵌套式PCR反應對細菌16S rDNA進行擴增，選用的引物參見表1。PCR反應物(25 μL)中加有模板 DNA 0.5 μL，引物各 0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，rTaq酶2.5 U，Tris-HCl(pH 8.3)10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，ddH2O補足至 25 μL。同時每一次實驗都要用ddH2O代替模板DNA做陰性對照。第1輪PCR反應產物稀釋50倍后當做第2輪PCR反應中的模板DNA。反應程序如下:27F-1492R:95℃ 5 min;95℃1 min，50 ℃ 1 min，72℃ 1 min，30 個循環;72℃ 10 min;F341(GC)-R518:94℃ 4 min;94℃ 45 s，55℃45 s，72 ℃ 45 s，30個循環;72 ℃ 10 min。各步的PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 DGGE分析

利用DCodeTMUniversal Mutation Detection System進行DGGE分析。電泳條件:8%的聚丙烯酰胺凝膠;變性劑(100%的變性劑濃度為7 mol/L尿素，40%甲酰胺)梯度范圍為45% ～65%，電泳時間5.5 h;電泳溫度60℃;電壓150 V;電泳緩沖液為1×TAE buffer。上樣前在60℃，150 V的條件下預電泳30 min。電泳結束后用SYBR GreenⅠ染色45 min，分3次進行，染色結束后用BioRad，Gel Doc XR凝膠成像系統進行拍照，利用Quantity One軟件對DGGE指紋圖譜進行聚類分析，計算生物多態性指數。DGGE條帶鑒定參照文獻［15］。

1.2.5 統計分析

利用生物學軟件Quantity One(Quantity One 4.6.2，BioRad，USA)對DGGE指紋圖譜進行處理分析，其中Phylogenetic Tree的聚類方法為UPGAMA。利用古生物學統計軟件Palaeontology Statistics，(http://folk.uio.no/ohammer/past/)進行生物多樣性指數的計算和PCA(Principal Component Analysis)分析。

表1 實驗中所用的PCR引物Table 1 PCR Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 采用分離培養法對江蘇啤酒大麥制麥過程中細菌群落進行分析

對各種微生物的計數結果見圖1，江蘇啤酒大麥制麥過程中細菌數量有明顯的變化:錐底浸麥時細菌數量有明顯減少，平底浸麥和發芽階段的細菌數量迅速增加，到發芽結束時細菌數量達到最大，而后隨著干燥的進行細菌數量不斷減少，但成品麥芽中的細菌數量比大麥還是有所增加。制麥過程的浸麥和發芽階段是各種微生物迅速增加的兩個主要階段，浸麥階段大麥的水分不斷增加，最終可達43% ～45%，非常適合細菌生長。而干燥階段的高溫會抑制微生物的生長甚至使部分菌群致死。利用一般常用的培養基對制麥過程大麥中的細菌進行分離，只能得到一部分細菌，如果要更加全面地檢測出盡可能多的細菌種類，需要配制多種有針對性的培養基進行分離，同時培養條件也要隨著菌種的不同而做調整［4］。

圖1 江蘇啤酒大麥制麥過程中細菌數量的變化情況Fig.1 Changes of total count of bacteria in malting process of Jiangsu malting barley using culture methods

2.2 nested PCR－DGGE對江蘇啤酒大麥制麥過程中的細菌群落進行分析

將樣品粉碎后，用Fast DNA Spin Kit For Soil進行總DNA的提取，以樣品總DNA為模板，按照1.2.3中的條件對細菌16S rDNA進行嵌套PCR擴增，擴增產物按照1.2.4的條件進行16S rDNA的DGGE分析，DGGE指紋圖譜見圖2。

圖2 制麥過程細菌16S rDNA PCR產物的DGGE指紋圖譜(編號B～M如圖1所述)Fig.2 16S rRNA gene DGGE fingerprinting of bacteria communities using the primers GC－F341/R518

圖2表明，制麥過程不同樣品中細菌條帶有明顯變化，大麥從浸麥到發芽，細菌種類顯著增多，而干燥、焙焦后的成品麥芽中細菌種類又明顯減少。其中條帶15在制麥過程的各階段都存在，其在大麥中含量相當豐富，最終麥芽中該細菌的量依然不少。

利用生物學軟件Quantity One對單二大麥制麥過程中細菌16S rDNA DGGE指紋圖譜(圖2)進行分析，得到量化數據及聚類分析圖(見圖3)，利用PAST軟件進行生物多樣性指數計算(表2)與PCA分析(圖4)。從圖3可以看出，啤酒大麥在儲藏、浸漬、發芽、焙焦等不同階段的細菌群落特征明顯不同，同階段樣品的細菌群落相似度較高，聚類結果非常接近，兩種引物的聚類結果略有不同。GC-F341/R518的聚類結果中樣品1、7和8分為一組，其余制麥中的樣品分為一組。

制麥過程中樣品細菌生物多樣性指數(表2)反映了大麥在制麥過程中細菌群落的豐富程度，從分析結果可知，大麥及成品麥芽的生物多樣性遠不及浸麥和發芽階段的樣品，GC-F341/R518引物對中的發芽樣品(G2)的物種豐度最高，香濃指數和辛普森指數也是最高，分別達到2.912和0.9409，但其細菌物種均勻性指數不是最高，為0.9198。

圖3 制麥過程樣品細菌16S rDNA nested PCR-DGGE的聚類分析(編號B～M如圖1所述)Fig.3 Cluster analysis of 16S rRNA gene DGGE fingerprinting of bacteria communities using the primers GC-F341/R518

圖4 細菌16S rDNA DGGE圖譜的PCA分析(編號B～M如圖1所述)Fig.4 PCA of the bacteria composition by PCR-DGGE analysis using primer sets GC-F341/R518

GC-F341/R518引物對的PCA分析(圖4)結果顯示，第一個主成分占44.48%，第二個主成分占29.68%。制麥過程中各樣品的分布相對分散，說明其中的細菌群落有明顯差異，主成分1最有可能受到樣品水分含量等的影響，主成分2主要受制麥工藝的影響。結果表明，制麥過程由于樣品水分含量、含氧量等條件的改變，細菌群落不斷發生著變化，排潮、焙焦結束后部分細菌被高溫環境抑制，細菌種類和數量急劇減少，但與大麥相比依然比較豐富，這與平板分離的結果一致。

表2 制麥過程樣品細菌16S rDNA Nested PCR-DGGE的生物多樣性指數Table 2 Microbial diversity indices calculated from the DGGE banding patterns shown in Fig.2

表3是制麥過程中各樣品細菌16S rDNA DGGE條帶的核酸序列分析結果。經分析，江蘇啤酒大麥制麥制麥過程中革蘭氏陰性細菌有不動桿菌屬(Acinetobactersp.)、腸桿菌屬(Enterobacter hormaechei)、歐文氏菌屬(Erwinia tasmaniensis)、黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyverasp.)、泛菌屬(Pantoeasp.)、法氏沃氏菌(Wautersiella falsenii)，革蘭氏陽性細菌有乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc lactis)、鏈球菌屬(Streptococcussp.)及多種未培養細菌(uncultured bacterium)。其中最主要的革蘭氏陰性菌為泛菌屬和不動桿菌屬，最主要的革蘭氏陽性菌為乳桿菌屬，革蘭氏陰性菌明顯多于革蘭氏陽性菌。克呂沃爾氏菌屬在制麥過程中一直存在且數量較多，其為小的桿狀細胞，與腸桿菌屬的定義相符。細菌產生的胞外多糖能夠造成釀造過程過濾困難，而江蘇啤酒大麥制麥過程出現的腸桿菌屬、乳桿菌屬等細菌很多都會產生胞外多糖，這些細菌快速生長過程產生的胞外多糖可能降低了麥芽的過濾性能。此外，有研究表明泛菌屬、歐文氏菌屬等細菌會影響麥汁和啤酒的過濾，從而造成啤酒混濁問題［16］。浸麥階段，好氧細菌會與大麥競爭氧氣進而抑制大麥的發芽。此外，大量細菌增值可能造成生物膜，同樣會對麥芽的過濾性能造成損害。

啤酒大麥中主要有歐文氏菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌、克呂沃菌屬和不動桿菌屬。浸麥階段，樣品水分含量增加，許多其他細菌開始生長，如腸桿菌屬和泛菌屬細菌，浸麥也會洗掉部分細菌如Acinetobacter johnsonii。發芽階段樣品中的細菌數量達到峰值，細菌種類也是最豐富的。排潮結束樣品中細菌種類有所減少，如Pantoea agglomerans和Flavobacteriumsp.。焙焦后成品麥芽中細菌種類較之前有明顯減少，但數量仍多于大麥，乳桿菌屬、明串珠菌屬和鏈球菌屬等細菌均未被檢測到。此外，條帶16代表Streptococcus iniae只在浸麥后期樣品S2中檢測到，極有可能是浸麥水帶入。

圖5是制麥過程中細菌群落的系統進化樹，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有很好的親緣分類，革蘭氏陽性菌中最主要的是乳酸菌，革蘭氏陰性菌種類較多。圖5中腸桿菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬與克呂沃爾氏菌屬細菌同屬于腸桿菌科，所以在進化樹中親緣關系最近;乳桿菌屬、明串珠均屬與鏈球菌屬細菌親緣關系接近;法氏沃氏菌和黃桿菌屬細菌同屬于黃桿菌科，親緣關系接近。

表3 制麥過程樣品細菌16S rDNA nested PCR－DGGE條帶鑒定結果Table 3 Sequencing results of the bands cut from the DGGE gels of the bacteria community

3 結論與討論

江蘇啤酒大麥制麥過程中細菌數量不斷發生著變化，浸麥初期細菌數量明顯減少，浸麥后期及整個發芽階段，細菌的數量都在不斷增加，發芽結束時達到峰值;干燥階段細菌數量不斷減少，成品麥芽中的細菌數量與最初的大麥相比略有增加。所以，加強制麥過程中洗麥工作對減少細菌數量，降低細菌對麥芽品質的影響至關重要。此外，成品麥芽的儲藏條件需要格外關注，一旦儲藏條件不合適，將會導致麥芽中微生物數量急劇增加，進而降低麥芽質量。

江蘇啤酒大麥制麥過程中主要的細菌有Acinetobacter，Enterobacter，Erwinia，Flavobacterium，Kluyvera，Lactobacillus，Lactococcus，Leuconostoc，Pantoea，Streptococcus，以及Wautersiella。其中Enterobacter，Erwinia和Pantoea是啤酒大麥中最常見的細菌。Laitila曾利用PCR-DGGE對啤酒大麥制麥過程中細菌進行了分析，也鑒定出Enterobacter，Erwinia和Pantoea這3種細菌［11］。Streptococcus在啤酒大麥中并不常見，可能是環境中的細菌，因此制麥過程做好設備環境等衛生工作也非常重要。

另外，還對比了制麥過程中單二大麥與加拿大Metcarlfe大麥的細菌群落結構差異，發現單二大麥制麥過程中細菌數量明顯偏高，單胞菌細菌較少，這些差異對單二麥芽品質有著潛在的影響。

通過比較傳統平板培養法分離得到的微生物和DGGE分析得到的微生物的種類，發現傳統分離得到的大部分微生物均會在DGGE分析中出現，但也有像Lysinibacillus fusiformis這樣的細菌并未在分子鑒定中出現，同時DGGE中檢測到的很多細菌種類并沒有在傳統分離培養中獲得，這可能有以下原因:DGGE分析中需要得到樣品中微生物的基因組才能最終檢測到該種微生物，但實際操作中無法非常全面地將所有細菌的DNA提取得到，尤其是原本數量較少的細菌種類;傳統分離培養不僅耗時，而且單一的培養基無法適合所有細菌的生長，只能得到少數種類的細菌。傳統平板培養法與DGGE分析相結合是比較合適的分析大麥細菌群落結構的。

圖5 制麥過程樣品細菌16S rDNA序列系統發育樹Fig.5 Phylogenetic relationships of 16S rDNA sequences of the bacteria community

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