大麥苗總黃酮提取工藝的優(yōu)化*

張輝，喬勇進(jìn)，戚文元

1(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，上海，201403)

2(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)3(上海束能輻照技術(shù)有限公司，上海，201401)

大麥(Hordeum vulgare)，屬大麥屬(Hordeum)，早熟禾科(Poaceae)，其嫩苗富含葉綠素、類黃酮、維生素、抗氧化酶及蛋白質(zhì)等多種功能營(yíng)養(yǎng)成分［1－2］。據(jù)報(bào)道大麥苗黃酮類化合物主要有皂草苷(saponarin)和大麥黃苷(lutonarin)［3－4］，其自由基清除能力和抗氧化性能顯著高于其他植物黃酮和黃酮碳苷［5］，具有抗癌、抗炎及防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等生理功能［6－7］。目前，天然植物黃酮類化合物提取原料有銀杏葉［8］、杜仲葉［9］及玉米須［10］等。以大麥苗為原料進(jìn)行總黃酮定向提取并對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化的研究鮮有報(bào)道。大麥苗因其原料具有種植周期短、成本低、產(chǎn)量大、易加工及副產(chǎn)物利用價(jià)值大等優(yōu)點(diǎn)，可作為總黃酮提取的原料。已有研究表明超臨界流體萃取、超聲波及微波輔助提取可增加植物黃酮類化合物的提取量［11－13］，而本文以乙醇溶液為提取溶劑，對(duì)大麥苗總黃酮進(jìn)行常溫浸漬提取，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)，優(yōu)化其最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六葉期大麥苗(品種:大中88－91)，采收于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田;無(wú)水乙醇(分析純 )、NaNO2(BR)、AlCl3(BR)、NaOH(BR)、蘆丁(純度 ＞95%)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 葉綠素提取工藝流程

大麥苗鮮樣→挑選、清洗、瀝干→真空冷凍干燥(預(yù)凍溫度，－45℃;冷阱溫度，－37℃;升華溫度，25℃;真空度，170 Pa)→粉碎(100目)→浸提→過(guò)濾→濾液→減壓濃縮成膏狀(水浴溫度，30℃;真空度，110 Pa)

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比和提取時(shí)間等3個(gè)因素均對(duì)大麥苗總黃酮提取量影響較大。故分別取其不同水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取其平均值進(jìn)行研究。

1.3.2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大麥苗總黃酮提取效果的影響

將粉碎干燥后的大麥苗過(guò)100目篩，稱取麥苗粉約2.50 g，置于250 mL錐形瓶中，按液固比為30∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃浸提90 min，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大麥苗總黃酮提取效果的影響。

在經(jīng)歷了這樣特殊的課程之后，從新加坡中學(xué)走出來(lái)的學(xué)生具有非常敏銳的“批判性思維”和“辯證思維”，他們的邏輯思維能力快速成長(zhǎng)，也同樣對(duì)于他們的學(xué)術(shù)課程大有助益。

1.3.2.2 不同液固比對(duì)大麥苗總黃酮提取效果的影響

將粉碎干燥后的大麥苗過(guò)100目篩，稱取麥苗粉約2.50 g，置于250 mL錐形瓶中，按液固比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃浸提90 min，研究不同液固比對(duì)大麥苗總黃酮提取效果的影響。

1.3.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)大麥苗總黃酮提取效果的影響

將粉碎干燥后的大麥苗過(guò)100目篩，稱取麥苗粉約2.50 g，置于250 mL錐形瓶中，按液固比為30∶1(mL∶g)加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以150 r/min轉(zhuǎn)速搖晃分別浸提 30、60、90、120、150 min，研究不同提取時(shí)間對(duì)大麥苗總黃酮提取效果的影響。

1.3.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)大麥苗總黃酮提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定了CCD的試驗(yàn)水平(表1)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可建立二次非線性回歸模型(式 1)［14］。

式中:Y，總黃酮提取量預(yù)測(cè)值;Xi，Xj，試驗(yàn)因素的編碼值;β0，βii，βij，截距及回歸常數(shù)(其中，Xi=，式中X為無(wú)量綱的編碼值，x為變量i的實(shí)ii際值，xio為變量i的零水平實(shí)際值。Δxi為變量i的步長(zhǎng)實(shí)際值，即編碼值變化一個(gè)單位所對(duì)應(yīng)的實(shí)際變化值)。

因子貢獻(xiàn)率采用式(2)計(jì)算［15］:

式中:SSj，因子平方和，SST，模型總平方和。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼水平Table 1 Values factors and their coded levels in central composite experimental design

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

浸提完成后將提取液置于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下低溫(10℃)離心15 min，取1 mL上清液，采用硝酸鋁比色法［16］測(cè)定其總黃酮含量。總黃酮提取量采用式(3)進(jìn)行計(jì)算。

式中:Y，大麥苗總黃酮提取量，μg/g;m，提取液中總黃酮含量，μg/mL;M，提取樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

CCD試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0.6.1(State-Ease，Inc.，USA)、SAS 9.2(SAS Inc.，USA)，Origin 8.0(Electronic Arts Inc.，USA)繪制單因素圖及效應(yīng)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1表明，大麥苗總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí)，總黃酮提取量最高。這可能是由于大麥苗中黃酮類化合物為弱極性物質(zhì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，其極性越接近大麥苗中黃酮類化合物的極性，導(dǎo)致總黃酮溶出量升高。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the flavonoids extraction yield

液固比對(duì)液相主體和固相主體之間的濃度差，即傳質(zhì)推動(dòng)力，影響較大。此外，液固比也會(huì)影響液固兩相的表觀傳質(zhì)系數(shù)，從而影響傳質(zhì)速率。圖2表明，隨著液固比的增加，大麥苗總黃酮提取量呈現(xiàn)先快速升高而后增加平緩的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵黾右汗瘫龋瑐髻|(zhì)動(dòng)力增加，黃酮就更容易溶出，損失減少;但液固比大于30 mL/g后增加速度趨于平緩。由于液固比較大會(huì)造成提取溶劑的浪費(fèi)及后期濃縮的困難，從總黃酮提取效果和經(jīng)濟(jì)邊際效應(yīng)兩方面綜合考慮，認(rèn)為進(jìn)行大麥苗總黃酮提取時(shí)液固比不宜高于40 mL/g。

圖2 液固比對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the flavonoids extraction yield

由圖3可知，總黃酮提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先逐漸升高而后降低的趨勢(shì)。大麥苗總黃酮提取量在提取時(shí)間為120 min時(shí)達(dá)到最大值，而在提取時(shí)間為150 min時(shí)略微降低。這可能因?yàn)檠娱L(zhǎng)提取時(shí)間使得更多的黃酮類化合物溶出，但一些黃酮類化合物易于氧化，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致總黃酮的溶出量小于其降解量，從而使得其提取量略微降低。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the flavonoids extraction yield

2.2 CCD試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

試驗(yàn)共設(shè)20次試驗(yàn)，其中包括14次析因試驗(yàn)及6次中心點(diǎn)試驗(yàn)。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取其平均值作為響應(yīng)值，試驗(yàn)按隨機(jī)順序進(jìn)行，其結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并建立三元二次回歸方程(式3):

表2 CCD設(shè)計(jì)矩陣及響應(yīng)值Table 2 Central composite design matrix and responses

2.2.2 回歸模型的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

由表3可知，判定系數(shù)(R2)為0.994 3，說(shuō)明模型相關(guān)性較好，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值有較大影響。校正判定系數(shù)(adjR2)為0.989 1，表明98.91%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋。變異系數(shù)(C.V.)為1.66%，表示試驗(yàn)的可信度和精確度較好。本試驗(yàn)精密度(adeq precision)為40.536 ＞4.0，表明其為一個(gè)適宜的信號(hào)。模型 F值為192.61，表明其達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比及提取時(shí)間等影響因素對(duì)總黃酮提取量的共同影響具有差異極顯著性，且模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)均達(dá)到顯著水平。此外，失擬F值為1.54(P=0.323 2＞0.05)，表明失擬值和純誤差沒有顯著性關(guān)系，即回歸模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域不失擬。綜上可知，該所建立模型可用于指導(dǎo)試驗(yàn)。此外，表3還表明，各一次項(xiàng) 、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)X2X3、X1X3均對(duì)大麥苗總黃酮提取量影響極顯著(P＜0.01)，交互項(xiàng)X1X2對(duì)總黃酮提取影響不顯著 (P＞0.05)。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of regression model significance test

圖4 因子貢獻(xiàn)率Fig.4 Percentage contributions of factors

2.2.3 模型效應(yīng)分析

2.2.3.1 主效應(yīng)分析

由于模型存在交互效應(yīng)，故不宜采用回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小來(lái)直接比較二次項(xiàng)、交互項(xiàng)作用的大小。因此，本試驗(yàn)均采用因子貢獻(xiàn)率來(lái)衡量各因子對(duì)總黃酮提取量的影響大小。圖4－a表明，二次項(xiàng)效應(yīng)＞一次項(xiàng)效應(yīng)＞交互項(xiàng)效應(yīng)。圖4－b表明，模型各項(xiàng)間乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次效應(yīng)影響最顯著，其次是其液固比，而乙醇體積分?jǐn)?shù)及液固比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對(duì)黃酮提取量影響最小。3個(gè)試驗(yàn)因素的效應(yīng)大小依次為液固比 ＞提取時(shí)間 ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3.2 兩因素效應(yīng)分析

由圖5－a、5－c知，大麥苗總黃酮的提取量隨液固比的增加呈現(xiàn)先快速增長(zhǎng)再緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)。液固比的增加可增加傳質(zhì)動(dòng)力，有助于總黃酮的溶出，但當(dāng)液固比達(dá)到一定程度時(shí)，已溶出大部分總黃酮，若再增加液固比，則總黃酮提取量增加緩慢。由5－a、5－e可看出，總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增大而后減小的趨勢(shì)。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大減小了提取液極性，使其更接近于總黃酮的極性，從而增加了總黃酮的溶出。但過(guò)度增加乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)導(dǎo)致提取液極性過(guò)小，從而偏離大麥苗總黃酮極性。5－c、5－e均表明，大麥苗總黃酮提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)曾先前期增加迅速，后期增加緩慢的趨勢(shì)。這可能是由于前期已溶出大部分黃酮，后期原料自身黃酮較少，故增加緩慢;也可能由于后期有部分黃酮發(fā)生降解，但降解速率仍小于溶出速率，從而呈現(xiàn)增長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象。圖5－b為液固比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線圖，其接近圓形，表明二者交互作用不顯著，圖5－d、5－e分別為液固比與提取時(shí)間的等高線圖及乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的等高線圖，其均為橢圓形狀，表明二者交互效應(yīng)顯著，這均與方差分析結(jié)果一致。

圖5 總黃酮提取量響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of total flavonoids extraction yield

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化與模型驗(yàn)證

規(guī)范分析［17］(canonical analysis)能求出響應(yīng)面的拐點(diǎn)并判斷其類型(最大值點(diǎn)、最小值點(diǎn)、馬鞍形點(diǎn))。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行規(guī)范分析(表4)，得到大麥苗總黃酮提取的一個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)，該點(diǎn)處理論響應(yīng)值為950.36。由于變量X2的編碼值的特征值為0.02，其較接近零值，在試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)可能會(huì)存在一個(gè)穩(wěn)定嶺系統(tǒng)，故一般需進(jìn)行嶺脊分析。

表4 規(guī)范分析結(jié)果Table 4 Results of canonical analysis

嶺脊分析(aidge analysis)是在以原始設(shè)計(jì)中心點(diǎn)為球心，以r為半徑的超球面與響應(yīng)面的交點(diǎn)所形成的軌跡范圍內(nèi)探測(cè)最佳響應(yīng)值［17］。嶺脊分析結(jié)果(表 5)表明當(dāng)超球面半徑(r)為 0.8，X1、X2、X3的特征值分別為 0.728 876、0.021 37、0.329 069 時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最大(950.346 3 μg/g)，其與規(guī)范分析所得的穩(wěn)定點(diǎn)較一致，故無(wú)穩(wěn)定嶺系統(tǒng)的存在，穩(wěn)定點(diǎn)為理論上的最優(yōu)點(diǎn)。

表5 脊嶺分析結(jié)果Table 5 Results of ridge analysis

考慮到試驗(yàn)操作的便利，將總黃酮提取工藝參數(shù)修正為液固比29、乙醇體積分?jǐn)?shù)90% 、提取時(shí)間100 min。采用修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得大麥苗總黃酮提取量為946.63 μg/g，與模型預(yù)測(cè)值相差 3.73 μg/g，差異在誤差允許范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了影響因子與大麥苗總黃酮提取量之間的三元二次回歸模型，確定了大麥苗總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為液固比29 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)90% 、提取時(shí)間100 min，在此工藝條件下，大麥苗總黃酮提取量為946.63 μg/g，其與預(yù)測(cè)值950.36 μg/g較一致。故該模型能反映大麥苗總黃酮提取過(guò)程的內(nèi)部規(guī)律，可較好地預(yù)測(cè)大麥苗總黃酮的提取情況，并能為黃酮類化合物提取原料的來(lái)源、進(jìn)一步提高大麥嫩苗資源利用率及大麥苗黃酮類化合物工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

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