基于酪氨酸酶的絲素蛋白膜的制備及其性能

李新玥，邢鐵玲

(蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇蘇州215021)

絲素蛋白具有良好的綠色環保性能，一直是人們研究的熱點。早期的絲素蛋白主要用于食品添加劑和化妝品中［1］。在目前的研究中，絲素蛋白由于與生俱來的無毒性、無刺激性，優良的生物相容性和可降解性等優勢，常被用于制備人工皮膚、人工骨骼、酶固定化材料、藥物緩釋載體、抗血凝性材料、細胞培養基質等生物醫用材料的重要可選原料［2］。

絲素蛋白溶液直接經一般條件烘干、靜電紡或冷凍干燥等方法制得膜、無紡網和多孔支架等不同形態的材料，其聚集態結構多以無規卷曲為主，分子間的結合力較弱，在水中溶失率大，限制了絲素蛋白材料的應用［3］。當前多采用各種物理和化學方法制備共混的絲素膜，從而得到耐水性好的材料。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種含銅的金屬酶，廣泛分布于微生物、動植物及人體中，它具有雙重的生物催化作用，既有單酚酶活性又有二酚酶活性，既能催化單酚類化合物生成鄰苯二酚，又能氧化鄰苯二酚脫氫生成鄰苯醌，能將酪氨酸羥化，產生L-多巴，然后再將多巴氧化成多巴醌，進而生成一系列引起褐化的色素類物質［4］。

絲素蛋白中含有18種氨基酸，其中酪氨酸、絲氨酸、谷氨酸和酪氨酸等約占氨基酸總量的30%。將酪氨酸酶引入到絲素蛋白體系中，它能催化其中的酪氨酸發生酶促氧化反應，使得蛋白質分子之間發生交聯［5-6］。基于這樣的反應原理，用酪氨酸酶作為交聯試劑，加入到絲素蛋白溶液中，在一定的條件下制成溶失率較低的交聯絲素膜。與現有的添加化學交聯劑成膜，如添加聚乙二醇縮水甘油醚形成不溶于水的絲素膜相比［7］，本研究具有生態、環保的優勢。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料:桑蠶絲(江蘇蘇豪國際集團股份有限公司)，酪氨酸酶(Sigma)，無水碳酸鈉，溴化鋰，透析袋。

實驗儀器:MP516型溶解氧分析儀(上海三信儀表廠)，TU-1810紫外/可見分光光度計(北京普析有限責任公司)，美國Instron3365萬能材料試驗機、YG(B)141D數字式織物厚度儀(溫州市大榮紡織儀器有限公司)。

1.2 絲素溶液的制備

家蠶生絲用無水碳酸鈉完全脫膠，經充分烘干后用9.3 mol/L的溴化鋰溶液溶解(60℃ ×30 min)，經透析、過濾之后得到絲素溶液，用稱重法計算絲素溶液的含固率。

1.3 絲素膜的制備

按照一定的比例將酪氨酸酶加入到絲素蛋白溶液中，在一定的工藝條件下反應，反應結束后將溶液置于準備好的盒子中風干，制得絲素膜。

2 實驗測試

2.1 酶促反應的溶解氧分析

用MP516型溶解氧分析儀在一定的條件下測試酶促反應體系溶解氧的變化情況。

2.2 絲素蛋白溶液吸光度測試

用紫外/可見光分光光度計在200～400 nm測定不同條件下絲素溶液的吸光度，并優化出最佳的反應工藝。

2.3 絲素膜的理化性能測試

2.3.1 含水率

將絲素膜在恒溫恒濕(25℃，相對濕度65%)下平衡24 h，每個稱取質量w1(g)的樣品3塊，然后在烘箱中105℃烘至恒重，稱量得到w2(g)。則根據公式(1)計算出含水率。

2.3.2 溶失率

將絲素膜在同一室溫條件下平衡24 h，然后稱取w3(g)，放入編過號的錐形瓶中，按浴比1︰100加入去離子水，在37℃的水浴恒溫震蕩器中預熱30 min后震蕩24 h，然后取出溶液。溶液離心后取上層清液，用紫外分光光度計測出各溶液在275 nm下的吸光度并記錄。由測出的吸光度，根據公式計算出溶解的絲素重量，即可得出絲素膜的蛋白溶失率。

式中:C為絲素蛋白溶失率，%;K為絲素溶液的紫外吸光常數，mL/g;A為吸光度;V為溶液體積，mL;w3為樣重品質量，g。

2.3.3 力學性能

將絲素膜剪成60 mm×10 mm的長條狀，編號后測定每個樣片的厚度。于恒溫恒濕(25℃，相對濕度65%)下平衡24 h后在Instron3365萬能材料試驗機上進行拉伸測試，夾距為20 mm，拉伸速度為20 mm/min。按公式計算膜的斷裂強度。

式中:P為膜的斷裂強度，MPa;F為膜的斷裂強力，N;d為膜的寬度，mm;h為膜的厚度，mm。

按公式計算膜的初始模量。

式中:E0為初始模量，MPa;Pa為拉伸負荷，N;l0為試樣的夾持長度，mm;Δla為試樣伸長值，mm;S為試樣橫截面積，mm2。

2.4 氨基酸分析

將待測絲素膜試樣置于水解管中，加入6.0 mol/L HCl溶液，與110℃下密封水解24 h，過濾，蒸干;再加入0.02 mol/L的HCl溶液，在真空中放置30 min，采用Hitachi 835-50氨基酸自動分析儀測定除色氨酸以外的其他氨基酸的質量分數。

2.5 X射線衍射分析

使用全自動X'PERT-PRO MPD射線衍射儀，CuKα射線，X射線波長:λ=1.5406?計數器:超能探測計數器，記錄得到絲素膜2θ=5°～50°的衍射強度曲線。

3 結果與討論

3.1 酶促反應的溶解氧分析

圖1為酪氨酸酶催化絲素蛋白上L-酪氨酸發生反應的原理式，該反應需要在氧氣存在的情況下才能正常進行［8］，如果不及時給反應浴補充氧氣，反應浴中的氧氣會逐漸減少。改變交聯反應的溫度，采用溶解氧分析儀對密閉的絲素溶液體系的溶解氧進行測試。測試結果如圖2所示，其溶解氧變化曲線可分為3個階段。反應前10 min，反應浴內的溶解氧含量充足，主要進行有氧反應，生成L-多巴和多巴醌。當反應進行到30 min左右時，體系內溶解氧含量逐漸降低，有氧反應和不需氧氣的邁克爾加成反應同時進行，并且達到一個相對平衡，所以在這一個階段氧氣消耗量趨于平緩。在最后一個反應階段，隨著反應進行，體系內溶解氧逐漸消耗而且沒有新的氧氣補充進來，體系內的氧氣逐漸消耗，直至被消耗完反應結束［9］。

圖1 酪氨酸酶對絲素蛋白的催化反應Fig.1 Catalytic reaction of silk fibroin by tyrosinase

圖2又可見，隨著反應溫度升高，體系內的溶解氧量消耗速度逐漸變快。當反應溫度為25℃時，反應進行70 min時體系內的溶解氧量只發生較小變化;當溫度升到45℃，反應進行到30 min時，體系內的溶解氧就降為零。即在同樣的反應配比下，反應浴溫度越高，酪氨酸酶越快發揮催化作用，使得酶促反應速率加快，反應浴內的氧氣消耗也相應加快，使得溶解氧曲線產生了如圖2所示的差異。因此，可以證明絲素上的酪氨酸殘基確實被酪氨酸氧化。

圖2 反應溫度對酶促反應的溶解氧消耗的影響Fig.2 Effect of enzymatic reaction temperature on oxygen consumption

3.2 酶促反應條件對絲素溶液吸光度的影響

3.2.1 酪氨酸酶用量對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

固定反應溫度和反應時間，改變酪氨酸酶的用量，用紫外分光光度計在200～400 nm對反應后的溶液的吸光度進行測試。

絲素和酪氨酸酶在一定的溫度和時間下反應，反應結束后，溶液由原來的無色透明變為紅棕色，隨著酶用量的增多這種變色更加明顯。如圖3所示，與空白的酪氨酸酶溶液和絲素溶液組對照，添加酪氨酸酶的溶液在340～360 nm的吸收顯著增大，并且隨著酪氨酸酶用量增加，吸光度逐漸增大，在350 nm出現了一個較寬的吸收峰。并且蛋白質在280 nm附近的吸收峰逐漸向300 nm移動。

如圖1反應機理所示，酪氨酸酶催化絲素蛋白反應會生成L-多巴和多巴醌。有研究指出，酪氨酸酶催化絲素蛋白反應后生成的300 nm和360 nm吸收峰分別是L-多巴和多巴醌的吸收峰［9-11］。當底物濃度相同時，反應后溶液的紅棕色越深，在340～360 nm的吸光度越大，則生成的L-多巴和多巴醌越多，即認為絲素蛋白的交聯程度越高，所以在本組實驗中4 000 U/g的酶量交聯效果最好(即每克絲素蛋白需要4 000 U的酪氨酸酶，下同)。

對汾河流域節水灌溉發展水平的準確評價，是正確認識汾河流域節水灌溉發展水平、推動本區域節水灌溉發展的基礎，是制定區域節水政策、方案和措施的科學依據。近年來，節水灌溉發展水平綜合評價已經由最初的定性描述分析或定量數據比較發展到定性與定量相結合[1]，由依靠主要指標構建簡單的評價體系發展到利用多指標或多目標構建綜合評價體系。

圖3 酪氨酸酶用量對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.3 Effect of tyrosinase dosage on absorption of silk-tyrosinase solution

3.2.2 反應溫度對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

固定酪氨酸酶用量和反應時間，改變反應溫度，對反應后溶液的吸光度進行測試。從圖4可以看出，改變反應溫度后，溶液的吸光度發生較大變化。從25℃開始升高反應溫度，反應后溶液的吸光度逐漸增大，當反應溫度升高到60℃時，溶液的吸光度反而降低。

圖4 反應溫度對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on absorption of silk-tyrosinase solution

反應溫度通過影響酪氨酸酶的活性影響反應后溶液的吸光度值。在一定范圍內，反應溫度太低，酪氨酸酶活性釋放較慢，反應需要很長時間;反應溫度太高，酪氨酸酶存在失活的可能。當反應溫度為25℃時酪氨酸酶緩慢釋放活力，相同時間內催化交聯的L-酪氨酸含量少，生成的L-多巴和多巴醌的量也相應較少，使得吸光度值也低。隨著溫度升高，酪氨酸酶活力釋放速度增大，交聯反應速率增大，生成較多的有色物質，吸光度值增大。但當溫度升高到60℃時，酪氨酸酶存在失活的可能，而且酪氨酸酶在較短的時間內釋放較多的酶活，一部分酪氨酸酶還沒來得及發生催化交聯就已經失去酶活，這對發揮酶的高效催化作用是不利的，導致最終反應后溶液呈現偏黃的棕色，吸光度值反而降低。綜合以上分析，選擇45℃為酶促反應的最佳溫度。

3.2.3 反應時間對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

固定酪氨酸酶用量和反應溫度，改變反應時間，對反應后溶液的吸光度進行測試。從圖5可以看出，隨著反應時間延長，絲素溶液在350 nm附近的吸收峰逐漸抬高，并且峰形越來越明顯。反應時間為0時，酶促反應并未開始，溶液在350 nm左右的吸光度值接近于0。隨著反應時間延長，酶促反應生成的L-多巴和多巴醌的量逐漸積累，在350 nm附近的吸光度值逐漸增大。在反應的前120 min內，350 nm附近的吸光度值快速增大，繼續延長反應時間，吸光度值有較小增大，但反應進行到120 min時繼續延長時間，反應后溶液的顏色從紅棕色向黃棕色變化，可能生成了其他更加復雜的催化產物，所以選定反應時間為120 min。

圖5 反應時間對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.5 Effect of reaction time on absorption of silk-tyrosinase solution

3.2.4 空氣和氧氣對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響

從上述溶解氧分析中可知，在密閉條件下酪氨酸酶催化酪氨酸殘基發生反應，體系內的氧氣會逐漸消耗直至殆盡。通過給反應浴中通氧氣和空氣的方法給反應浴中補充氧氣，用不通任何氣體作為對照，對反應后溶液吸光度進行測試。如圖6所示，通氧氣的絲素溶液反應后在350 nm的吸光度值明顯大于通空氣和對照組的。

圖6 空氣和氧氣對絲素-酪氨酸酶溶液吸光度的影響Fig.6 Effect of air and oxygen on absorption of silk-tyrosinase solution

3.3 絲素膜的溶失率和力學性能

在上述工藝條件下，改變酪氨酸酶的用量，用流延法制成絲素膜，并對所成絲素膜的溶失率膜的力學性能進行測試。如圖7所示，純絲素膜的溶失率為24%，隨著酶用量增大，膜的溶失率逐漸降低，當酶用量增大到2 000 U/g時，膜的溶失率降到了11.2%，當酶用量繼續增大到1︰4 000 U/g時，溶失率只有3.2%。斷裂強度也有同樣的變化趨勢，在初始酶用量較少時，膜的斷裂強度只有較小程度的提高，當酶用量增大到1︰2 000 U/g時，膜的斷裂強度達到了最大值，但是當酶用量繼續增大到1︰4 000 U/g時，膜的斷裂強度反而降低。

圖7 酪氨酸酶用量對絲素膜的溶失率和斷裂強度的影響Fig.7 Effect of tyrosinase dosage on water solubility and rupture strength of SF membrane

當底物濃度相同時，一定范圍內，隨著酪氨酸酶用量的增多，酶促交聯反應進行的更加充分，蛋白質之間交聯程度更大，所以膜的溶失率和斷裂強度逐漸改善。

表1為用不同量的酪氨酸酶交聯絲素蛋白所成絲素膜的初始模量和斷裂伸長率分析。隨著酪氨酸酶用量增多，絲素膜的初始模量逐漸增大，當酪氨酸酶用量為4 000 U/g時，膜的初始模量迅速降低，幾乎等同于未交聯膜的初始模量。隨著酪氨酸酶用量增多，膜的初始模量增大，可認為隨著交聯程度的增大，膜的斷裂由原來的韌性斷裂向脆性斷裂轉變。但當酶用量增大到一定程度之后對膜的交聯沒有更大的改善，使其初始模量降低。從斷裂伸長率的數據可以看出，酪氨酸酶用量發生改變，膜的斷裂延伸率幾乎不發生變化。

表1 酪氨酸酶用量對絲素膜的初始模量和斷裂伸長率的影響Tab.1 Effect of tyrosinase dosage on elongation and initial modulus of crosslinked SF membrane

綜上所述可認為，酪氨酸酶對絲素蛋白的交聯作用，較大程度地改善了膜的溶失率和斷裂強度，但是膜的韌性有所降低。

3.4 絲素膜的氨基酸分析

交聯與未交聯絲素膜的氨基酸含量分析如表2中所示。交聯反應對絲素膜中氨基酸的種類無影響，但對各種氨基酸的含量有較大影響。未交聯絲素膜中酪氨酸的質量分數為8.41%，交聯絲素膜中酪氨酸含量逐漸減少，并且隨著酪氨酸酶用量增多，其中酪氨酸含量逐漸降低(當酪氨酸酶用量為4 000 U/g時，膜中的酪氨酸含量僅為6.36%)。

已知酪氨酸酶可以特定的催化酪氨酸發生氧化反應，在本研究中當絲素蛋白底物濃度不變時，在一定的范圍內隨著酪氨酸酶用量增多，酪氨酸發生催化氧化的機率增多，則有更多的酪氨酸參與氧化反應，最終使得其中酪氨酸含量減少。這一結果與上述研究相吻合，進一步驗證了酪氨酸酶催化絲素蛋白中的酪氨酸，發生了氧化交聯反應。

表2 絲素膜的氨基酸含量分析Tab.2 Amino acid composition of silk membrane %

3.5 絲素膜的X射線衍射分析

如圖8所示，兩種絲素膜在12.2°(Silk I)和9.1°(Silk II)均無明顯吸收峰，說明純絲素膜和酪氨酸酶催化交聯絲素膜均以無歸卷曲結構為主。只是絲素膜在20°的峰形稍為尖銳，這說明交聯前后絲素膜的結晶結構沒有發生明顯變化。從膜的熱水溶解性分析可知，交聯后膜的熱水溶失率明顯降低，這說明在絲素蛋白結構聚集態結構未發生變化的情況下，絲素蛋白分子之間形成了交聯，這種交聯使絲素分子結構從線性向體型轉變，從而使其不溶于水。X射線衍射結果進一步說明酪氨酸酶催化了絲素蛋白大分子的交聯反應。

圖8 絲素膜的X射線衍射分析Fig.8 X-ray diffraction curves of SF membrane

4 結論

通過交聯前后絲素溶液吸光度的變化，優選出酪氨酸酶催化絲素蛋白溶液交聯反應的最佳工藝為:酪氨酸酶用量4 000 U/g，反應溫度45℃，反應時間120 min。并用流延法制得了交聯絲素蛋白膜，對所成膜的24 h熱水溶失率和膜的力學性能進行了測試，對照交聯與未交聯的絲素膜，膜的熱水溶失率和力學性能有較大改善。膜的氨基酸含量分析結果表明交聯前后絲素膜中的酪氨酸含量減少，證明酪氨酸酶可催化其發生反應。X射線衍射結果表明交聯絲素膜仍以無規卷曲結構為主，與未經交聯的絲素膜相比，聚集態結構無顯著變化。綜合以上分析可知，酪氨酸酶可以催化絲素大分子間的交聯反應。

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