血漿1，3-β-D-葡聚糖檢測對惡性血液病患者侵襲性真菌感染的診斷價值

陳 巖， 王淑惠， 黃寶青， 倪 雄， 黃曉春， 秦陽華

(1.上海市長海醫(yī)院實驗診斷科，上海200433;2.上海醫(yī)藥高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗09級，上海201318;3.上海市長海醫(yī)院血液內(nèi)科，上海200433)

血液病患者常因大劑量化療、骨髓干細(xì)胞移植和免疫抑制劑的使用，具有較高的發(fā)生侵襲性真菌感染(invasive fungal diseases，IFD)的風(fēng)險。IFD發(fā)病快、病情重、病死率高，是血液病患者死亡的主要病因之一，并且早期診斷困難，抗真菌治療不及時是目前IFD病死率較高的主要原因。IFD確診困難，主要依賴于無菌標(biāo)本真菌培養(yǎng)陽性(如血液培養(yǎng)出念珠菌屬真菌)或組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)有真菌菌絲和/或孢子，組織病理陽性是診斷IFD的金標(biāo)準(zhǔn)，但組織標(biāo)本往往取材困難，并具有創(chuàng)傷性，標(biāo)本也需要特殊染色，耽誤了患者的診斷和治療。為了更快、更準(zhǔn)確地診斷IFD，近年一些新的指標(biāo)被引入用于診斷IFD，包括1，3-β-D-葡聚糖檢測(G試驗)和半乳甘露聚糖檢測(GM試驗)。由于G試驗可以檢測出臨床常見的2種IFD［包括系統(tǒng)性念珠菌病(systemic candidas)和肺曲霉病(pulmonary aspergillosis)］而被廣泛用于臨床檢測。我們系統(tǒng)分析了G試驗在診斷惡性血液病患者IFD中的價值。

材料和方法

一、研究對象

以2010年3月至2011年11月在長海醫(yī)院血液科住院治療的血液腫瘤患者為研究對象，共計220例，男133例，女87例，年齡13～87歲，均為經(jīng)病理診斷確診的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，包括73例IFD患者，其中確診4例(5.5%)、臨床診斷29 例(39.7%)、擬診40 例(54.8%)。

二、方法

血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度檢測采用北京金山川公司MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。以試劑盒推薦的診斷值(20 pg/mL)判定G試驗陽性。

IFD診斷依據(jù)中國IFD工作組制定的《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則》［1］(2010年第3次修訂)并做適當(dāng)調(diào)整，即G試驗結(jié)果單獨作為診斷指標(biāo)和不考慮G試驗結(jié)果時根據(jù)臨床表現(xiàn)、微生物檢驗、影像和病理結(jié)果診斷，分為確診、臨床診斷和擬診IFD，并以患者發(fā)熱(＞38.5℃)時間為研究起點確定診斷時間。

傳統(tǒng)診斷方法指不考慮G試驗結(jié)果綜合患者易感因素、臨床特征、影像和實驗室等其他指標(biāo)根據(jù)《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則》(2010年第3次修訂)診斷。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，2組數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度單指標(biāo)診斷惡性血液病患者IFD的性能

G試驗陽性與傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)比較結(jié)果見表1。在220例患者中G試驗診斷陽性患者97例，與傳統(tǒng)試驗方法診斷的73例患者相比，G試驗有較高的敏感性，但會出現(xiàn)假陽性，G試驗陰性的患者可以排除IFD的可能性，G試驗指標(biāo)診斷惡性血液病患者IFD的敏感性為98.6%［95%可信區(qū)間(CI):92.60%～99.97%］，特異性為83.0%(95%CI:75.93%～88.68%)，陽性預(yù)測值為74.2%(95%CI:64.4%～82.6%)，陰性預(yù)測值為99.2%(95%CI:95.6%～99.9%)。2 種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 惡性血液病患者血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度單指標(biāo)診斷IFD和傳統(tǒng)診斷方法的比較 (例)

二、血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度診斷惡性血液病患者IFD的受試者工作特征(ROC)曲線

血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度在0～100 pg/mL范圍內(nèi)診斷惡性血液病患者IFD的ROC曲線見圖1。ROC曲線下面積為0.946 1(95%CI:0.92～0.98)。取≥10 pg/mL為診斷閾值時敏感性為100.0%(95%CI:91.4%～100.0%)，特異性為75.2%(95%CI:67.2%～82.1%);取≥20 pg/mL為診斷閾值時敏感性為97.6%(95%CI:87.1%～99.9%)，特異性為85.8%(95%CI:79.0%～91.1%);取≥50 pg/mL為診斷閾值時敏感性為36.6%(95%CI:22.1%～53.1%)，特異性為97.8%(95%CI:93.9%～99.6%)。

三、血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度幫助早期診斷惡性血液病患者IFD

以72例惡性血液病患者發(fā)生IFD前發(fā)熱(體溫≥38.5℃)為起點，統(tǒng)計患者G試驗結(jié)果陽性時間和按照傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷時間，結(jié)果見圖2。G試驗陽性時間(3.86±2.92)d，而傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷時間(7.52±4.32)d。以血漿 1，3-β-D-葡聚糖作為診斷指標(biāo)可以顯著縮短IFD的診斷時間(P＜0.01)。

圖1 惡性血液病患者血漿1，3-β-D-葡聚糖診斷IFD的ROC曲線

圖2 G試驗和傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷IFD所需時間

討 論

IFD是惡性血液病患者的常見并發(fā)癥。由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查陽性率低、影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，常導(dǎo)致IFD的診斷存在較大難度，常發(fā)生誤診和漏診。目前歐美及國內(nèi)IFD的診斷標(biāo)準(zhǔn)只有2條:組織病理學(xué)證據(jù)和活組織標(biāo)本或正常情況下無菌腔液標(biāo)本培養(yǎng)陽性［2］，而血液病患者病情較危重且常合并其他感染性疾病，累及部位不明確，侵入性檢查較難實施，難以確診。傳統(tǒng)真菌檢測方法的檢出率低，如痰培養(yǎng)曲霉菌的檢出率僅為8%～34%［3］，因而 IFD有著較高的死亡率。IFD常見臨床類型為系統(tǒng)性念珠菌病和肺曲霉病，其病原體分別是念珠菌屬(Candida spp)和曲霉屬(Aspergillus spp)，念珠菌屬和曲霉屬真菌有相似的細(xì)胞壁成分——1，3-β-D-葡聚糖，是廣泛存在于除接合菌及隱球菌以外的真菌細(xì)胞壁中的一種多糖，占細(xì)胞壁干重的50%以上，在酵母樣真菌中含量最高［4-5］。淺表真菌感染時1，3-β-D-葡聚糖極少能釋放入血液，而當(dāng)發(fā)生IFD時經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理，1，3-β-D-葡聚糖可從真菌壁釋放入體液，從而使血及其他體液中的1，3-β-D-葡聚糖濃度明顯上升［6］。因此可以用血漿 1，3-β-D-葡聚糖診斷深部真菌感染，并且1，3-β-D-葡聚糖僅存在于真菌的細(xì)胞壁中，細(xì)菌和人類細(xì)胞壁不存在1，3-β-D-葡聚糖，故G試驗陽性對于診斷深部真菌感染具有較好的特異性。采用血清真菌細(xì)胞壁成分曲霉半乳甘露聚糖抗原和1，3-β-D-葡聚糖抗原檢測診斷IFD的特異性和敏感性可達(dá)80%以上［7］。對于G試驗在診斷IFD的價值許多學(xué)者都進(jìn)行了研究，Pazos等［8］研究結(jié)果顯示，血漿G試驗的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為87.5%、89.6%、70.0% 和96.3%，有超過 2/3的患者該指標(biāo)的陽性結(jié)果明顯早于臨床癥狀和影像學(xué)異常，提示該指標(biāo)對IFD早期診斷可能有利，并發(fā)現(xiàn)血漿1，3-β-D-葡聚糖濃度可隨病情而動態(tài)變化，對判斷病情和療效有一定意義。G試驗敏感性和特異性的不同與實驗設(shè)定的閾值有關(guān)［9］，而對于G試驗在診斷IFD時的閾值仍有爭議。本研究采用MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)分別比較以10、20、50 pg/mL為閾值時診斷IFD的敏感性、特異性。通過對結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，以≥20 pg/mL為診斷閾值時曲線下面積最大，敏感性為97.6%(95%CI:87.1%～99.9%)，特異性為85.8%(95%CI:79.0%～91.1%)，而且相比于傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷時間(7.52±4.32)d，G試驗只需要(3.86±2.92)d，明顯縮短了 IFD的診斷時間，為臨床診斷和治療贏得了寶貴時間。G試驗在診斷IFD中的價值越來越受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其在2008年修訂的深部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)中將G試驗納入微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，使IFD的診斷率明顯提高［10］。因此 1，3-β-D-葡聚糖可作為IFD的早期無創(chuàng)檢測指標(biāo)之一。如果能較好的利用G試驗就可以減少診斷時間，較早的對疾病進(jìn)行治療。但G試驗檢測受到干擾因素較多，有一定的假陽性率。在本研究中確診的IFD患者73例，而G試驗陽性97例，有假陽性的結(jié)果。分析導(dǎo)致假陽性的原因有:某些醫(yī)療物品中含有葡聚糖，某些品牌的靜脈制劑(白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等)中含葡聚糖，鏈球菌敗血癥患者［11］，化療或放療引起的黏膜炎癥使食物中的葡聚糖可以通過受損的胃腸道黏膜進(jìn)入到血液中，以真菌作為原料制成的抗菌藥物［12］。并且在念珠菌、曲霉菌、卡氏肺囊蟲感染均可出現(xiàn)G試驗陽性，故G試驗只能確定有無真菌感染，不能鑒定具體菌種。由于抗真菌藥物的長期應(yīng)用，其他多種少見的真菌也在逐漸增多［13］，而關(guān)于 G試驗假陰性的報道較少，Pickering等［14］報道G試驗以80 pg/mL為陽性閾值的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為93.3%、77.2%、51.9%、97.8%，指出 G 試驗最有用的價值是其陰性預(yù)測值較高，陰性結(jié)果可以排除IFD。本研究數(shù)據(jù)亦支持此結(jié)論，G試驗排除IFD的患者均為IFD陰性。

總之，G試驗在診斷IFD有著較高的敏感性和特異性，可以在疾病早期進(jìn)行診斷，為臨床醫(yī)生盡早干預(yù)治療節(jié)約時間，降低患者死亡率，并且可以結(jié)合G試驗較好的陰性預(yù)測值排除IFD，可幫助臨床合理用藥，防止抗真菌藥物的過度使用。

［1］《中華內(nèi)科雜志》編輯委員會.血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(修訂版)［J］.中華內(nèi)科雜志，2007，46(7):607-610.

［2］黃曉軍.血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)［J］.中華內(nèi)科雜志，2005，44(7):554-556.

［3］Khan ZU，Ahmad S，Theyyathel AM.Detection of Aspergillus fumigatus-specific DNA，(1-3)-beta-D-glucan and galactomannan in serum and bronchoalveolar lavage specimens of experimentally infected rats［J］.Mycoses，2008，51(2):129-135.

［4］Odabasi Z，Mattiuzzi G，Estey E，etal.Beta-D-glucan as a diagnostic adjunct for invasive fungal infections:validation，cutoff development，and performance in patients with acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome［J］. Clin Infect Dis，2004，39(2):199-205.

［5］廖萬清.侵襲性真菌感染的實驗室診斷［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25(7):503-506.

［6］呂沛華，趙蓓蕾，施 毅，等.侵襲性肺部真菌感染動物模型制作及血漿β-葡聚糖檢測的診斷價值［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17(11):1328-1331.

［7］Verweij PE，F(xiàn)igueroa J，Van Burik J，etal.Clinical applications of non-culture based methods for the diagnosis and management of opportunistic and endemic mycoses［J］.Med Mycol，2000，38(Suppl 1):161-171.

［8］Pazos C，Pontón J，Del Palacio A.Contribution of(1-＞3)-beta-D-glucan chromogenic assay to diagnosis and therapeutic monitoring of invasive aspergillosis in neutropenic adult patients:a comparison with serial screening for circulating galactomannan［J］.J Clin Microbiol，2005，43(1):299-305.

［9］Persat F，Ranque S，Derouin F，etal.Contribution of the(1-＞3)-beta-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections［J］.J Clin Microbiol，2007，46(3):1009-1013.

［10］De Pauw B，Walsh TJ，Donnelly JP，etal.Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group(EORTC/MSG)Consensus Group［J］.Clin Infect Dis，2008，46(12):1813-1821.

［11］Digby J，Kalbfleisch J，Glenn A，etal.Serum glucan levels are not specific for presence of fungal infections in intensive care unit patients［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2003，10(5):882-885.

［12］高 蕾，周 新.(1，3)-β-D葡聚糖檢測在侵襲性真菌感染中的診斷意義［J］.中國感染與化療雜志，2008，8(2):123-125.

［13］Aubry A，Porcher R，Bottero J，etal.Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders［J］.JClin Microbiol，2006，44(2):389-394.

［14］Pickering JW，Sant HW，Bowles CA，etal.Evaluation of a(1-＞3)-beta-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections［J］.J Clin Microbiol，2005，43(12):5957-5962.