6周遞增負荷運動對大鼠小腸集合淋巴結(jié)細胞線粒體凋亡途徑的影響

王雪芹，郝選明

（1.華南師范大學 體育科學學院，廣東 廣州 510006；2.臨沂大學 體育學院，山東 臨沂 276005）

小腸集合淋巴結(jié)(Peyer’s patches，PP結(jié))是免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和活化部位，其淋巴細胞最終離開 PP結(jié)歸巢到腸黏膜固有層，進一步分化為成熟漿細胞并分泌IgA發(fā)揮免疫效應(yīng)[1]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，遞增負荷運動會導(dǎo)致PP結(jié)淋巴細胞凋亡增加[2]。而長期大強度運動誘導(dǎo) PP結(jié)淋巴細胞凋亡及機制研究甚少，為了進一步證實遞增負荷運動誘導(dǎo) PP結(jié)淋巴細胞的凋亡及機制，本研究著重探討遞增負荷運動過程中，PP結(jié)淋巴細胞線粒體膜電位的變化、細胞凋亡關(guān)鍵分子細胞色素C(Cytochrome C，簡稱Cyt C)的變化及與線粒體凋亡通路密切相關(guān)的促凋亡基因 BaxmRNA和抗凋亡基因 Bcl-2mRNA的表達情況，遞增負荷運動過程中 PP結(jié)淋巴細胞的線粒體凋亡機制，為長期大強度運動誘導(dǎo)免疫細胞凋亡及機制研究提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象與分組

SPF級雄性SD大鼠(8周齡，64只，購自廣東中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK (粵)2008-0020；NO:0104976，粵監(jiān)證字 F2008A002)被隨機分為實驗組和對照組，各為32只。實驗組進行6周遞增強度訓練，對照組，正常喂養(yǎng)，不進行運動干預(yù)，于第0、2、4、6周末各從實驗組和對照組取8只大鼠臟器并測試相關(guān)指標(最后一次運動后48 h無菌采樣)。

1.2 運動方案

采用本課題組反復(fù)實驗探索的 6周遞增負荷模型。先采用低強度適應(yīng)性運動(10 m/min)訓練1周后，負荷遞增至 20 m/min。隨后每周遞增負荷增量 5 m/min。至第6周，達到40 m/min。

1.3 測試指標與方法

1)線粒體膜電位測定：JC-1膜電位檢測試劑盒(JC-1)購于碧云天生物技術(shù)研究所(C2006)，采用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測。無菌條件下，從小腸壁上切取PP結(jié)，取200目鋼網(wǎng)極輕柔研磨細胞，400目尼龍網(wǎng)過濾。收集的細胞用冷PBS離心(200 g，5 min)洗滌2次，懸浮于含100 mL/L胎牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，計數(shù)并且調(diào)整細胞濃度，取5×105細胞，重懸于0.5 mL細胞培養(yǎng)液中，加入0. 5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后，離心3 min(600 g ，4 ℃)，沉淀細胞。棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2次后，再用1 mL的JC-1染色緩沖液重懸，并立即進行流式細胞儀檢測。數(shù)據(jù)采用 WinMDI 2.9軟件進行分析處理，計數(shù)紅色熒光強度平均值和綠色熒光強用紅色熒光強度與綠色熒光強度的比值代表線粒體膜電位去極化程度。

2)Bax、Bcl-2mRNA的測定：RNAiso Plus和SYBR?Premix Ex TaqTM反應(yīng)試劑購自(TaKaRa)大連寶生物公司；引物(見表1)委托上海Invitrogen公司合成；采用全自動熒光定量PCR儀進行測定。

表1 Bax基因、Bcl-2基因和GAPDH管家基因引物序列

3)細胞色素C的測定：采用ELISA檢測，Cyt C濃度測定嚴格按照檢測試劑盒(R＆D systems)說明書要求進行。在酶標儀(Tecan Infinite F200)上，于450 nm波長讀取光密度值，根據(jù)標準曲線計算出Cyt C的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(x±s)表示，用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理；組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)進行分析。P<0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有非常顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 對照組測試指標的變化

第0、2、4、6周，對照組的PP結(jié)線粒體膜電位、PP結(jié)淋巴細胞Bax、Bcl-2mRNA和Cyt-C濃度差異沒有顯著性(P<0.05)，表明6周生長對這些指標沒有影響。

2.2 長期遞增負荷運動對PP結(jié)線粒體膜電位的影響

線粒體對JC-1的攝取依賴于跨膜電位，正常PP結(jié)淋巴細胞線粒體的膜電位高，細胞受損后，線粒體膜電位下降。在JC-1染色中，受到ΔΨm和制約，因此，很多研究數(shù)值來反映ΔΨm[4]。本研究結(jié)果顯示，6周遞增負荷運動中，4周顯高于0周，差異具有顯著性(P<0.05)。0周到4周PP結(jié)淋巴細胞ΔΨm持續(xù)下降，6周PP結(jié)淋巴細胞ΔΨm略有上升。2、6周PP結(jié)淋巴細胞ΔΨm與0周相比，差異具有顯著性(P<0.05)；4周PP結(jié)淋巴細胞ΔΨm與0周相比，差異具有非常顯著性(P<0.01)(見表2)。

表2 長期遞增負荷運動過程中PP結(jié)ΔΨm的變化

2.3 長期遞增負荷運動對 PP結(jié)淋巴細胞 Bax和Bcl-2mRNA的影響

結(jié)果顯示，6周遞增負荷運動中，與0周相比，2、4、6周BaxmRNA表達升高，其中4和6周的BaxmRNA表達明顯高于0周，差異具有顯著性(P<0.05)；與0周相比，4、6周Bcl-2mRNA表達降低，其中4和6周Bcl-2mRNA表達明顯低于 0周，差異具有非常顯著性(P<0.01)；4周與2周相比，Bcl-2mRNA表達明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)；與0周相比，2、4、6周Bcl-2/Bax明顯降低，差異具有非常顯著性(P<0.01)(見表3)。

表3 長期遞增負荷運動過程中PP結(jié)淋巴細胞Bax和Bcl-2mRNA的變化

2.4 長期遞增負荷運動對PP結(jié)淋巴細胞Cyt C質(zhì)量濃度的影響

結(jié)果顯示，遞增負荷運動過程中，2、4、6周PP結(jié)淋巴細胞Cyt C濃度分別為(3.859±0.241)、(8.456±0.289)、(8.143±0.286) ng/mL，明顯高于與0周的(1.675±0.205) ng/mL，差異具有非常顯著性(P<0.01)；4和6周PP結(jié)淋巴細胞Cyt C濃度明顯高于2周的，差異具有非常顯著性(P<0.01)。

3 討論

3.1 遞增負荷運動過程中線粒體膜電位與PP結(jié)淋巴細胞凋亡及機制

本研究探討了6周遞增負荷運動過程中PP結(jié)淋巴細胞ΔΨm的變化。結(jié)果顯示，在遞增負荷運動過程中，2、4、6周的ΔΨm明顯低于0周，且4周的降低最明顯，提示在6周遞增負荷運動降低了PP結(jié)淋巴細胞的ΔΨm，導(dǎo)致了淋巴細胞凋亡的增加。

運動對大鼠淋巴結(jié)淋巴細胞凋亡及凋亡機制的研究報道非常少。ΔΨm的降低與細胞凋亡密切相關(guān)。其可能機制為：線粒體不但是細胞的動力工廠，而且是細胞凋亡信號的提供者。ΔΨm是觀察線粒體通透性，評價線粒體功能的敏感指標[8]。ΔΨm的降低表明線粒體內(nèi)膜的通透性增加，細胞受損[4]。線粒體功能改變與細胞凋亡密切相關(guān)，包括線粒體膜電位的喪失、胞漿內(nèi)鈣失衡、活性氧(ROS)過度生成、細胞色素C的釋放及細胞Bcl-2家族促進和抑制凋亡蛋白的參與[9]。當?shù)蛲鲂盘杺鬟f至線粒體，同時激活第2信使如Ca2+、Bcl-2(Bax)、神經(jīng)酰胺和活性氧等，第2信使也作用于線粒體，使線粒體釋放出 Cyt-c，Cyt-c與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)和 Caspases-9形成復(fù)合體，導(dǎo)致 Caspases-9的激活，激活 Caspases-9繼續(xù)激活下游效應(yīng)因子Caspases-3、6、7，使細胞進入凋亡[10-11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增負荷運動期間，腸道淋巴細胞凋亡程度與組織自由基含量變化基本一致，運動應(yīng)激性自由基生成與腸道淋巴結(jié)細胞凋亡有關(guān)[2]。與本研究相結(jié)合，說明遞增負荷運動會導(dǎo)致自由基過度生成，線粒體氧化酶活性下降，進而引發(fā)內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化，使內(nèi)膜的流動性下降和膜通透性增加，滑扣、質(zhì)子漏和電子漏增加，導(dǎo)致線粒體膜電位降低甚至喪失，促使了PP結(jié)淋巴細胞凋亡的發(fā)生。Krüger等[12]以C57BL/6為研究對象，進行一次力竭性遞增負荷運動，發(fā)現(xiàn)PP結(jié)淋巴細胞凋亡在運動后3、24 h明顯增加；MDA水平升高，ROS增加；Fas+和FasL+也明顯增加。另外，以Fas缺陷MRL/lpr小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)運動誘導(dǎo)下，脾臟、肺、骨髓和淋巴結(jié)處淋巴細胞凋亡被阻止，而PP結(jié)淋巴細胞仍有凋亡出現(xiàn)，說明介導(dǎo)PP結(jié)淋巴細胞凋亡的可能是其他凋亡途徑，如運動誘導(dǎo)血清糖皮質(zhì)激素濃度提高、自由基生成過度等。另外，Bax和Bcl-2的變化趨勢與上述ΔΨm的變化趨勢是一致的，且在一定誘導(dǎo)條件先，會促使 Bax寡聚體形成并整合到線粒體外膜上，使線粒體發(fā)生一系列變化，說明在遞增負荷運動中，Bax和Bcl-2也可能參與了PP結(jié)淋巴細胞凋亡的過程。

3.2 遞增負荷運動過程中的 Bax、Bcl-2、Cyt C與PP結(jié)淋巴細胞凋亡及機制

Bcl-2家族是目前最受關(guān)注的調(diào)控細胞凋亡的基因家族，目前共發(fā)現(xiàn)30個成員。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，編碼的蛋白包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL等，促進凋亡蛋白包括Bax、Bcl-10、Bid等[5]。Bax蛋白與Bcl-2蛋白具有氨基酸順序上的同源性，二者形成復(fù)雜二聚體，對抗Bcl-2抑制細胞凋亡的作用。Bcl-2/Bax比值決定著細胞受到刺激后是發(fā)生凋亡還是幸存。如果 Bcl-2/Bax比值降低，會促進線粒體釋放細胞色素 C，激活下游因子，裂解底物，誘導(dǎo)細胞凋亡[6]。淋巴結(jié)淋巴細胞凋亡率達到峰值時，Bax蛋白表達也最強，而Bcl-2與Bcl-XL蛋白則明顯下降，即Bax、Bcl-2與Bcl-XL在淋巴結(jié)淋巴細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[7]。本研究結(jié)果顯示，隨著運動負荷的遞增，從0周到4周，PP結(jié)淋巴細胞BaxmRNA表達持續(xù)增加，6周BaxmRNA表達比4周略有降低，但明顯高于0周；第4和6周PP結(jié)淋巴細胞Bcl-2mRNA表達明顯低于0周，4周的降低最顯著；2、4和6周PP結(jié)淋巴細胞Bcl-2/Bax值也明顯低于0周，尤其4周最低。即遞增負荷運動過程中，尤其在0至4周，機體對負荷的反應(yīng)較大，到6周反應(yīng)略有減小，提示機體的運動機能可能提高了。與課題組前期研究結(jié)果是一致的[2]。另外，在遞增負荷運動過程中，0至4周隨著負荷的加大，Cyt C質(zhì)量濃度明顯增加。Cyt C具有激活caspase的作用，是線粒體參與凋亡的直接證據(jù)。

Bax、Bcl-2和Cyt C與PP結(jié)淋巴細胞凋亡的可能機制：正常情況下，Bax以單體形式存在于胞質(zhì)，但隨著遞增負荷的進行，PP結(jié)淋巴細胞凋亡蛋白BaxmRNA表達增加，可能會導(dǎo)致Bax寡聚體形成并整合到線粒體外膜上，使線粒體外膜通透性增加，線粒體膜電位降低，使游離的Cyt-c釋放至胞質(zhì)，通過激活一系列下游基因發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用，使 PP結(jié)淋巴細胞凋亡增加。另外，前期研究發(fā)現(xiàn)，大強度運動會導(dǎo)致自由基過度生成，丙二醛(MDA)生成量增加，超氧化物歧化酶(SOD)的活性降低[2]，也可能會導(dǎo)致淋巴細胞凋亡蛋白Bax表達的增加，進而引起線粒體膜電位的改變，Cyt-c釋放增加，促進凋亡的發(fā)生。

遞增負荷運動會導(dǎo)致小腸集合淋巴結(jié)淋巴細胞 Bax基因表達增加，Bcl-2基因表達降低，Bcl-2/Bax值降低，線粒體膜電位明顯降低，Cyt-c釋放增加，小腸集合淋巴結(jié)淋巴細胞凋亡增加。其凋亡的可能機制為：遞增負荷運動導(dǎo)致自由基過度生成，超氧化物歧化酶活性降低，促使抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA表達下降，凋亡蛋白BaxmRNA表達增加，其寡聚體形成并整合到線粒體上，引起線粒體外膜通透性改變，線粒體膜電位下降，使游離的Cyt-c釋放至胞質(zhì)增加，進入胞質(zhì)的Cyt-c引起線粒體凋亡通路的下游基因發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用，使淋巴細胞凋亡增加。因此，遞增負荷運動可能是通過線粒體通路介導(dǎo)小腸集合淋巴結(jié)淋巴細胞凋亡的。

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