E2F－1、NF－κB/P65、P－gp在彌漫性大 B細胞淋巴瘤中的表達及意義

朱皓皞 杜麗英 熊敦勇 寇 輝 王芳勝

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人中最常見的一型淋巴瘤，占西方國家成人非霍奇金淋巴瘤的25% ～30%，在發展中國家還要高些［1］。治療DLBCL傳統的CHOP化療方案(環磷酰胺、阿霉素、長春新堿及強的松)5年存活率為30% ～49%［2］，仍有部分患者預后較差，因此需要進一步確定預后因素及治療的靶目標。本實驗采用免疫組織化學SP法檢測DLBCL中 E2F-1、NF-κB/P65和P-gp的表達，探討其在DLBCL中表達的相關性，并結合臨床資料及隨訪資料分析它們與臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

61例DLBCL組織石蠟標本取自解放軍第九四醫院2006年6月～2011年10月初治的DLBCL患者。所有病理切片經2位有經驗的病理醫師復核，符合WHO的診斷標準。所入選的病例均接受了2周期或以上的CHOP方案為基礎的聯合化療，加或不加放療。全組患者男性32例，女性29例;年齡13～80歲，中位年齡53歲，平均年齡49.6歲;采用Ann Arbor分期，其中Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期28例;有B癥狀者20例，無B癥狀者41例;LDH值≥300 IU/L者25例，LDH值＜300 IU/L者36例;IPI值低危者31例，低中危者10例，中高危者16例，高危者4例。這61例患者中，隨訪到生存資料可作回顧性分析的有26例，其中男性11例，女性15例;年齡13～80歲，中位年齡54.5歲，平均年齡50.46歲;采用Ann Arbor分期，其中Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期12例;有B癥狀者9例，無B癥狀者17例;IPI值低危者11例，低中危者5例，中高危者8例，高危者2例。26例患者中存活15例，死亡11例，5年存活率57.7%。另選15例同期反應性增生的淋巴結作為對照組。所有標本采用10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.2 試劑與方法

即用型E2F-1鼠抗人單克隆抗體，購自上海長島生物技術有限公司。即用型NF-ΚB/P65鼠抗人多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。即用型P-gp鼠抗人單克隆抗體，購自福州邁新生物技術有限公司。免疫組化SP兩步法具體試驗步驟按試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗做陰性對照，已知陽性結果做陽性對照。

1.3 結果判斷

E2F-1表達以細胞核內出現棕黃色顆粒，且陽性細胞數 ＞10% 為“+ ”［3］。NF-κB/P65:細胞質或胞核內出現棕黃色顆粒，且陽性細胞數 ＞50%為“+”［4］。P-gp:細胞膜或細胞質內出現棕黃色顆粒，陽性細胞數＞10%為“+”［5］。

1.4 隨訪

隨訪采用病歷跟蹤、電話隨訪及信函隨訪的方式，生存期的計算從確診到隨訪截止日期(2012年6月30日)，或死亡的日期為止，所有病例平均隨訪時間為36個月(6～60個月)。

1.5 統計學方法

采用SPSS13.0軟件進行數據分析，各組間樣本率的比較采用卡方檢驗及Fisher確切概率法;E2F-1、NF-κB/P65、P-gp表達的相關性采用Spearman秩和相關分析;5年生存率的統計采用Kaplan-Meier生存分析(組間比較采用Log Rank檢驗)。

2 結果

2.1 E2F-1、NF-κB/P65、P-gp 在 DLBCL 中的表達

E2F-1、NF-κB/P65、P-gp 在 DLBCL 中的陽性表達率分別為 42.6%(26/61)、52.5%(32/61)、54.1%(33/61);在對照組淋巴結反應性增生中陽性表達率分別為 80.0%(12/15)、0(0/15)、13.3%(2/15)，組間差異均有統計學意義，P＜0.05(表1)。

表1 E2F-1、NF-κB/P65、P-gp在反應性增生淋巴結和 DLBCL組織中的陽性表達(例，%)

2.2 DLBCL 中 E2F-1、NF-κB/P65 和 P-gp 表達的相關分析

E2F-1和NF-κB/P65在DLBCL中的表達呈明顯負相關(γ = －0.507，P ＜0.05，表 2)。NF-κB/P65 和P-gp在DLBCL中的表達呈明顯正相關(γ=0.638，P＜0.05)。E2F-1和P-gp兩者在DLBCL中的表達呈明顯負相關(γ = －0.404，P ＜0.05)，見表2，3。

2.3 E2F-1 、NF-κB/P65 和 P-gp與臨床特征的關系

在61例DLBCL組織中，E2F-1陽性表達與性別、年齡、Ann Arbor分期、IPI評分、LDH值及B癥狀均無關(P ＞0.05)。NF-κB/P65 陽性表達與 Ann Arbor分期及IPI評分有關，與性別、年齡、LDH值及B癥狀均無關(P＞0.05)。P-gp陽性表達與IPI評分有關，與性別、年齡、Ann Arbor分期、LDH值及B癥狀均無關(P ＞0.05)，見表 4。

表2 DLBCL中E2F-1與NF-κB/P65、P-gp表達的相關性(例)

表3 DLBCL中NF-κB/P65與P-gp表達的相關性(例)

表4 DLBCL組織中、NF-κB/P65、P-gp的表達與臨床病理特征的關系(例，%)

2.4 E2F-1 、NF-κB/P65 和 P-gp與預后的關系

E2F-1陽性表達者5年生存率明顯高于E2F-1陰性者，兩組間差異有統計學意義(P=0.03)。NF-κB/P65陽性表達者5年生存率明顯低于NF-κB/P65陰性表達者，差異有統計學意義(P=0.01)。P-gp陽性表達者的5年生存率雖然低于P-gp陰性表達者，但差異不具有統計學意義(P=0.12)，見圖1～3。

圖1 E2F-1的表達與預后的關系

圖2 NF-κB/P65的表達與預后的關系

圖3 P-gp的表達與預后的關系

3 討論

3.1 E2F-1在DLBCL中的表達及意義

E2F-1最初是由Rovesdi等在研究腺病毒時發現的，它對于E2基因啟動子的激活是必需的［6］。研究表明E2F-1是1個致瘤基因。Suh等［7］對72例卵巢上皮腫瘤進行研究時發現45.8%的患者高表達E2F-1，且E2F-1的過表達與分裂指數有關，是1個預后不良的指標。Ebihara等［8］對122例食管鱗狀細胞癌患者的研究發現73例患者過表達E2F-1，E2F-1與腫瘤的進展有關，高表達E2F-1的患者手術后預后不良。E2F-1的過表達還可以提高人類頭頸部腫瘤細胞株的侵襲性［9］。這些都表明E2F-1在腫瘤中發揮了癌基因的作用，E2F-1的這種作用可能與E2F-1能夠促進與DNA復制和G1/S期轉化有關的靶基因的轉錄及表達，促進細胞進入S期從而促進細胞增殖有關。之前的研究結果表明 E2F-1的陽性率為 34% ～83%［3，10］，本實驗結果符合文獻報道。本實驗同時發現15例反應性增生的淋巴結中有12例陽性表達，陽性表達率為80%，兩者的表達差異具有統計學意義，表明E2F-1的低表達可能與DLBCL的形成有關。進一步研究發現E2F-1陽性表達者的5年生存率明顯高于E2F-1陰性表達者，它們之間的差異具有統計學意義，提示E2F-1可以作為判斷腫瘤預后的1個指標，這個結果與Moller等的研究結果一致［3］。

3.2 NF-ΚB/P65在DLBCL中的表達及意義

核轉錄因子NF-κB是1種可以與免疫球蛋白(Ig)κ輕鏈基因的增強子的κB序列(GGGACTITCC)特異性結合的核蛋白因子，不僅在免疫反應和炎癥反應中發揮了重要作用，近年來的研究表明NF-κB在腫瘤的發生發展過程中也發揮了重要的作用。Aranha等［11］的研究表明NF-κB的激活在結直腸腫瘤的發生發展中發揮了重要作用，其在結直腸腫瘤組織中的陽性率明顯高于正常結直腸黏膜，且從腺瘤到低分化腺癌NF-κB/RelA 的陽性率逐漸增高。Davis等［12］的研究表明NF-κB的持續性活化對于活化的B細胞樣彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞(ABC-DLBCL)株的生存是必須的，ABC-DLBCL患者擁有1個不好的預后，本研究結果也表明NF-κB是1個預后不良的指標。在我們的實驗中，61例DLBCL中有32例陽性表達，陽性表達率為52.5%;15例反應性增生的淋巴結均不表達，進一步研究發現，NF-κB/P65的陽性表達與Ann Arbor分期晚及IPI評分高有關，提示NF-κB/P65的陽性表達可能與DLBCL的發生發展相關，NF-κB/P65的激活可能可以促進DLBCL的侵襲性發展。生存分析發現，NF-κB/P65陽性表達者的5年生存率明顯低于 NF-κB/P65陰性表達者，它們之間的差異具有統計學意義，表明NF-κB是1個預后不良的指標。

3.3 P-gp在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及意義

DLBCL患者以化療為主，雖然DLBCL為化療敏感的淋巴瘤，但仍有一部分患者不能治愈。近年來研究表明腫瘤細胞對抗癌藥物產生多藥耐藥是影響腫瘤治愈的主要原因之一。在多藥耐藥機制中研究的最多的是由MDR1基因編碼的P-gp。P-gp不僅在正常組織中存在，在腫瘤細胞中也有表達，P-gp的表達與蒽環類抗生素、長春堿類、紫杉醇類、鬼臼毒素類等化療藥物的耐藥有關。本組研究發現61例DLBCL患者中P-gp的陽性率為54.1%，這說明彌漫性大B細胞瘤中存在著一定程度的原發性多藥耐藥。對于P-gp陽性的患者應合理選擇化療藥物，避免使用與P-gp介導的MDR有關的抗腫瘤藥物，同時可聯合使用耐藥逆轉治療，最終達到治愈淋巴瘤的目的。另外本研究同時表明P-gp的表達與DLBCL患者的預后無關，這個結果與Masahiko等［5］的研究一致。

3.4 DLBCL 中 E2F-1、NF-κB/P65 和 P-gp 表達的相互關系

本實驗發現在 DLBCL組織中 E2F-1和 NF-κB/P65之間表達呈顯著負相關，表明E2F-1可以抑制NF-κB/P65的活性，從而發揮它的促凋亡作用，這與國內外現有研究結果相符。Phillips等［13］的研究表明E2F-1可以通過抑制IκB激酶的活性而抑制NF-κB的活性來促進凋亡，該研究同時表明E2F-1可以減少TRAF2，而TRAF2能夠參與了NF-κB的活化。本實驗也發現NF-κB與P-gp之間存在顯著正相關，表明NF-κB參與了腫瘤的多藥耐藥。NF-κB是重要的核轉錄因子，它調控著許多基因包括MDR1基因的表達。Kuo等［14］在MDR1促進子上發現了1個NF-κB結合位點，用胰島素能夠刺激NF-κB亞基P50(P65)在核內與該位點結合，促進MDR1表達。在K562/A02細胞株中P-gp和MDR1與NF-κB/p65呈正相關，通過抑制NF-κB可以減少MDR1 mRNA和P-gp的表達［15］。這些證據都表明NF-κB可以通過促進P-gp的表達而參與耐藥的發生。

本研究還發現DLBCL組織中E2F-1與P-gp存在顯著負相關，可能是E2F-1抑制了NF-κB的活性，從而使P-gp表達減少，增加了腫瘤對化療的敏感性，抑制了多藥耐藥的發生。最近的研究也表明，在一些腫瘤中E2F-1的過表達與化療的敏感性呈正相關，Russo等［16］的研究表明在骨肉瘤細胞株中，E2F-1的過表達顯著地增加了細胞對紫杉堿和長春堿的敏感性。

綜上所述，E2F-1和 NF-κB/P65的表達水平與DLBCL患者的預后密切相關，而P-gp則與預后無關。本研究同時發現DLBCL患者中存在一定程度的原發性多藥耐藥。

［1］Steven H，Elias C，Nancy LH，et al.WHO Classification of tumors.Pathology and genetics of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues〔M〕.Lyon:IARC Press，2008:233.

［2］Amytage JO，Weisenburger DD.New approach to classifying non-Hodgkins lymphoma:clinical features of the major histologic subtypes.Non-Hodgkins lymphoma Classification Project〔J〕.J Cli Oncol，1998，16(8):2780.

［3］Moller MB，Kania PW，Ino Y，et al.Frequent disruption of the RB1 pathway in diffuse large B cell lymphoma:prognostic significance of E2F-1 and p16INK4A〔J〕.Leukemia，2000，14(5):898.

［4］Espinosa I，Briones J，Bordes R，et al.Activation of the NF-κB signalling pathway in diffuse large B-cell lymphoma:clinical implications〔J〕.Histopathology，2008，53(4):441.

［5］Masahiko Ohsawa，Yoshihiro Ikura，Hiroko Fukushima，et al.Immunohistochemical Expression of Multidrug resistance proteins as a predictor of poor response to chemotherapy and prognosis in patients with nodal diffuse large B-cell lymphoma〔J〕.Oncology，2005，68(4-6):422.

［6］Rovesdi I，Rcielel R，Novins JR.Identification of a cellular transcription factor involved in ElA transactivation〔J〕.Cell，1986，45(2):219.

［7］Suh DS，Yoon MS，Choi KU，et al.Significance of E2F-1 overexpression in epithelial ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2008，18(3):492.

［8］Ebihara Y，Miyamoto M，Shichinohe T，et al.Over-expression of E2F-1 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with tumor progression〔J〕.Dis Esophagus，2004，17(2):150.

［9］Zhang SY，Liu SC，Johnson DG，et al.E2F-1 gene transfer enhances invasiveness of human head and neck carcinoma cell lines〔J〕.Cancer Ress，2000，60(21):5972.

［10］A K H Shia，G-G Gan，S Jairaman，et al.High frequency of germianal centre derivation in diffuse lage B cell lymphoma from Asian patients〔J〕.J Clin Pathol，2005，58(9):962.

［11］M M Aranha，P M Borralho，P Ravasco，et al.NF-κB and apoptosis in colorectal tumourigenesis〔J〕Eur J Clin Inves，2007，37(5):416.

［12］Davis RE，Brown KD，Siebenlist U，et al.Constitutive nuclear factor kappaB activity is required for survival of activated B cell-like diffuse large B cell lymphoma cells〔J〕.J Exp Med，2001，194(12):1861.

［13］Phillips AC，Ernst MK，Bates S，et al.E2F-1 potentiates cell death by blocking antiapoptotic signaling pathways〔J〕.Mol Cell，1999，4(5):771.

［14］Kuo MT，Liu Z，Wei Y，et al.Induction of human MDRl gene expression by 2 acelylaTllinofluoxene is mediated by effectors of the phosphoinositide 3-kinase pathway that activate NF-kappaB signaling〔J〕.Oncogene，2002，21(13):1945.

［15］張海濤，王 漪，余 敏，等.K562/A02細胞株核因子-KB活性與P糖蛋白的表達〔J〕.西安交通大學學報(醫學版)，2006，27(4):349.

［16］Russo AJ，Magro PG，Hu Z，et al.E2F-1overexpression in U2OS cells increases cyclin B1 levels and cdc2 kinase activity and sensitizes cells to antimitotic agents〔J〕.Cancer Res，2006，66(14):7253.