高效液相色譜法-蒸發光散射檢測器測定碎巖散中黃芪甲苷的含量※

高 侃 魏 東 耿 惠 劉敏彥

(河北省辛集市第二醫院放化療科，河北 辛集 052360)

碎巖散是河北省辛集市第二醫院自主研發的中藥復方制劑，由黃芪、炮附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃等組成，用于治療氣虛陽微型中晚期食管癌。黃芪為君藥，具有補氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌的功效[1]，主要含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸和多種微量元素[2]，其中黃芪甲苷為主要活性指標成分之一。為有效控制其質量，我們采用高效液相色譜法-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定碎巖散中黃芪甲苷的含量，結果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國Agilent公司)，配有HPLC泵(Agilent G1311A Quat Pump)，自動進樣器(Agilent G1313A ALS)；柱溫箱(Agilent G1316A Colcom)；脫氣機(Agilent G1379A Degasser)；Alltech-2000型蒸發光散射檢測器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)。

1.1.2 試藥 黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)；碎巖散(河北省辛集市第二醫院，批號110501)；甲醇為色譜純(美國Fisher公司)，水為雙蒸餾水，三氯甲烷、正丁醇、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 供試品溶液制備 取碎巖散約4 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，濾過，精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中蒸干，殘渣用水20 mL定量轉移至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取2次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，水層用水飽和的正丁醇提取4次(20 mL/次)，合并正丁醇液，用0.1% 氫氧化鈉(NaOH)溶液洗滌2次(10 mL/次)，再用正丁醇飽和的水洗滌2次(10 mL/次)，合并堿洗液和水洗液，用水飽和的正丁醇提取2次(10 mL/次)，與上述正丁醇液合并，置水浴上蒸干，殘渣用75%甲醇定量轉移至10 mL容量瓶中至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.1.2 黃芪甲苷對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每mL約含黃芪甲苷0.1 mg的溶液，即得。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為 Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(75∶25)，流速為0.8 mL/min，ELSD檢測漂移管溫度為100 ℃，氣體流速為3 L/min，分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10、20 μL與供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，用ELSD測定，以外標兩點法對數方程計算黃芪甲苷含量即得。理論塔板數按黃芪甲苷峰計算應不低于4 000。

1.2.3 線性關系考察 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液(98.18 μg/mL)5、10、20、30、50 μL注入高效液相色譜儀中，進行測定。以進樣量的自然對數為橫坐標，峰面積積分值的自然對數為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10 μL，分別連續進樣5次，測定峰面積，測定相對標準偏差(RSD)。

1.2.5 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，每隔4 h進樣1次，進樣量10 μL，測定峰面積。

1.2.6 重復性試驗 取同一批碎巖散，分別稱取高(5 g)、中(4 g)、低(3 g)3個劑量，每個劑量3份，按照1.2.1.1項下制備方法，分別進行超聲提取，制備，注入高效液相色譜儀測定。

1.2.7 陰性試驗 按照碎巖散的制備方法制成不含黃芪的模擬制劑，按照1.2.1.1項目制備方法制成陰性對照品溶液，按含量測定方法進行測定。

1.2.8 加樣回收率試驗 采用加樣回收實驗，取同一批碎巖散9份，分別加入低、中、高3個濃度的黃芪甲苷對照品溶液50 mL，按照1.2.1.1項下制備方法，進行提取，制備，測定，計算回收率。

1.2.9 耐用性試驗 對不同的色譜柱、不同的柱溫和漂移管溫度變化時對黃芪甲苷含量的影響進行考察。

2 結 果

2.1 線性關系考察 黃芪甲苷在5～50 μL (即0.490 9～4.909 μg)范圍內呈良好的線性關系，其進樣量的自然對數與峰面積積分值的自然對數回歸方程為：Lny=1.712 Lnx+7.106，r=0.9 998。

2.2 精密度試驗 黃芪甲苷RSD為2.19%，說明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗 在測定的24 h內，黃芪甲苷RSD為2.23%，說明溶液在24 h內基本穩定。

2.4 重復性試驗 黃芪甲苷RSD為1.67%，說明方法的重現性良好。

2.5 陰性試驗 其他組分對測定無干擾，見圖1、2、3。

圖1 黃芪甲苷對照品色譜圖

圖2 陰性對照品色譜圖

圖3 碎巖散色譜圖

2.6 加樣回收率試驗 黃芪甲苷的平均回收率為99.54%(n=9)，RSD為1.93%，說明方法準確度良好，見表1。

表1 加樣回收率結果

2.7 耐用性試驗 更換不同的色譜柱(Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；Agilent Zorbax XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；Phenomenon Gemini C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)測定同一份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為2.53%；柱溫發生變化(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，測定同一份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為2.05%；漂移管溫度發生變化(75 ℃、80 ℃、85 ℃)，測定同一份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為2.22%。

3 討 論

供試品的處理采用了甲醇超聲提取、正丁醇萃取的方法，操作簡便，為減少其他成分的干擾，采用堿水對正丁醇萃取液進行了處理，所得供試品圖譜清晰。

黃芪甲苷為末端紫外吸收物質，采用紫外檢測器200 nm左右的檢測波長進行測定時，雜質對色譜峰的干擾較大，基線不平穩。而ELSD為通用型質量檢測器，適合于無紫外吸收的皂苷類化合物的檢測。ELSD的響應值的大小由被測化合物顆粒的數量和大小決定，而不受流動相溶劑的干擾，溶劑在漂移管中全部蒸發。該方法靈敏度高，回收率及重現性均較好，且空白無干擾，適用于碎巖散中黃芪甲苷的含量測定。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版：一部[M].北京：化學工業出版社，2010：283-284.

[2] 江燕，晁若冰.黃芪藥材中黃芪甲苷和總皂苷含量的比較[J].華西藥學雜志，2007，22(3)：322-324.