銅綠微囊藻葉綠素熒光對HgCl2毒性響應特性的研究

徐小惠，段莉麗，崔建升

(1.河北科技大學環境科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省污染防治生物技術實驗室，河北石家莊 050018)

葉綠素熒光現象是由Kautsky在1931年首先用肉眼發現[1]，之后逐步發展形成葉綠素熒光理論。葉綠素分子吸收光后會由基態躍遷到激發態，激發態不穩定，會通過進行光合作用、發出熒光和以熱的形式耗散而釋放能量，三者具有互補關系。對于色素分子來講，熒光發生在ns級，而光化學反應發生在ps級，一般光能主要是用于光化學消耗的，所以可以通過熒光的變化探測光合機構的變化和光合作用受環境等的影響[2-3]。

LU等在2000年利用葉綠素熒光技術研究了汞對藍藻的急性毒性作用，發現隨Hg2+濃度的升高，鈍頂螺旋藻各葉綠素熒光參數逐漸下降[4]。EULLAFFROY等在2003年利用LS50B-PerkinElmer熒光儀研究幾種除草劑對斜生柵藻的毒性作用，研究結果表明，斜生柵藻在684 nm和735 nm處的葉綠素熒光比率(F684/F735)可作為檢測水中抑制光合作用的除草劑毒性的指標，隨著除草劑濃度的增大，F684/F735也不斷增大，且呈正相關關系[5]。王麗等在2008年利用雙通道脈沖振幅調制葉綠素熒光儀測量三角褐指藻的熒光強度，對莠去津進行檢測，熒光強度隨莠去津濃度的增大而增大，其檢出限為0.5 μg/L[6]。田程在2010年利用葉綠素在線分析儀測量斜生柵藻熒光強度，以HgCl2為參比毒物，初步建立毒性評價等級[7]。葉綠素熒光方法檢測方便，且靈敏快速，得到了廣泛的應用。

藻類是水體的初級生產者，最先受到水環境中污染物的毒害作用[3，8-9]，且藻類熒光對污染物毒性作用敏感，故藻類熒光常被用來研究污染物對微藻的影響。汞能抑制藻類光合作用，影響其葉綠素合成；還可影響藻類的生長，損傷細胞膜導致細胞膜通透性增大[10]。銅綠微囊藻屬藍藻，在水環境中很常見，且會在溫暖的季節大量生長形成水華，其主導光合色素為葉綠素a和藻藍蛋白，對應的熒光激發波長為435 nm和610 nm[11]，其熒光信號對重金屬等污染物敏感。本文以銅綠微囊藻為材料，研究不同質量濃度的Hg2+在較短時間內對銅綠微囊藻葉綠素熒光的影響，探索銅綠微囊藻對Hg2+的響應特性，豐富葉綠素熒光法的理論和應用。

1 材料與方法

1.1 生物材料

實驗所用銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)藻種購于中國科學院武漢水生生物研究所。

使用BG-11培養基，于無菌條件下將生長至對數期的銅綠微囊藻轉接到新鮮培養基中，置于恒溫光照培養箱中培養。銅綠微囊藻的培養條件是：光照度為2 000～2 500 lux，溫度為(25±1)℃，濕度為75% RH，光暗周期為12 h∶12 h，靜置培養。每日搖瓶2～3次，每次隨機調換錐形瓶的位置，以免引起光照不均。

通過實驗得出銅綠微囊藻在680 nm處[12]的光密度(DD)小于0.600時，其藻液濃度與葉綠素熒光強度呈正相關關系。在實驗前對生長至對數期的銅綠微囊藻藻液進行稀釋, 使之在680 nm處的OD值為0.400。

1.2 儀器與試劑

RGX-250型人工氣候箱(天津市泰斯特儀器有限公司提供)、722型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司提供)、日立F-7000熒光光譜儀(天美(中國)科學儀器有限公司提供)。F-7000熒光光譜儀工作參數：狹縫為5 nm，掃描速度為2 400 nm/min，激發波長為400～500 nm，發射波長為600～700 nm，步長為5 nm，電壓為700 V，1 cm的標準四通石英比色皿。

HgCl2，由姜堰市環球試劑廠提供。實驗設定HgCl2的質量濃度分別為0.000 5，0.001，0.010，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500 mg/L。

1.3 葉綠素熒光參數測定

使用F-7000熒光光譜儀進行葉綠素熒光參數的測定。先對銅綠微囊藻進行三維掃描，初步確定銅綠微囊藻的激發/發射波長[13]，然后進行波長掃描，比較激發與發射光譜圖，確定銅綠微囊藻葉綠素熒光的最佳激發波長(Ex)與發射波長(Em)，然后在該Ex/Em波長下測定加入HgCl2標準液前后銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度。

2 結果與分析

2.1 銅綠微囊藻特征參數的確定

葉綠素a的激發與發射波長為435 nm/684 nm，而不同介質中的葉綠素a具有不同的熒光光譜[14]，故不同種類的藻的葉綠素最佳激發波長與發射波長不同。F-7000熒光光譜儀對銅綠微囊藻在激發波長為435 nm處進行熒光光譜掃描，獲得銅綠微囊藻熒光光譜圖(見圖1)。由圖1可知，銅綠微囊藻在680 nm處有一峰，對應熒光強度最大；在660 nm前有一個相對平緩的峰，對應的是銅綠微囊藻的藻藍蛋白。最終確定銅綠微囊藻葉綠素熒光的最佳激發波長與發射波長為435 nm/680 nm。

2.2 銅綠微囊藻葉綠素熒光對Hg2+毒性作用的響應時間的確定

圖1 銅綠微囊藻在激發波長為435 nm處的熒光光譜Fig.1 Chlorophyll fluorescence emission spectra of Microcystis aeruginosa at 435 nm excitation

為了提高水質檢測效率，縮短檢測時間，建立一種快速簡便的水質檢測方法，即需要在短時間內檢測信號對毒物毒性有響應。實驗采用葉綠素熒光技術，在銅綠微囊藻藻液中加入1 mL的HgCl2溶液，檢測熒光信號對Hg2+的毒性的響應作用，發現葉綠素熒光強度隨時間變化增大，熒光信號有明顯響應。據報道，溫度對藻的葉綠素熒光參數與生長有影響[15]，可能也會對葉綠素熒光響應Hg2+的毒性時間有影響。用不同溫度處理藻液，觀測溫度對響應時間的影響，以獲取最佳反應溫度，縮短響應時間。

圖2 不同溫度處理銅綠微囊藻響應HgCl2生物毒性的影響Fig.2 Temporal evolution of chlorophyll fluorescence intensity in temperature-exposed Microcystis aeruginosa

圖3 不同初始藻液濃度對銅綠微囊藻葉綠素熒光響應Hg2+毒性作用的響應時間的影響Fig.3 Temporal evolution of chlorophyll fluorescence intensity in Microcystis aeruginosa with different initial concentration

圖2表明，溫度分別為20，23，25，27，30 ℃時，加入HgCl2標準液的銅綠微囊藻葉綠素熒光強度隨時間的變化趨勢基本一致，均逐漸增強。在0～10 min內葉綠素熒光強度緩慢增大，在10～20 min內熒光強度急劇增大，銅綠微囊藻與Hg2+充分反應，且銅綠微囊藻葉綠素熒光強度在20 min時達到最大，20 min后熒光強度趨于穩定。故20～30 ℃范圍內的溫度均可作為實驗溫度。從圖2中還可以看出隨溫度的增加，葉綠素熒光強度有一定降低。這與報道中的結論一致，所有的熒光都不同程度的受溫度影響, 溫度與熒光成反比[16]。

實驗中還發現使用培養時間不同但均處于生長對數期的藻液(即未經稀釋的初始藻液濃度不同)進行實驗，獲得的響應時間不同。用滅菌的蒸餾水將不同濃度銅綠微囊藻均稀釋至OD值為0.400進行響應時間實驗，發現銅綠微囊藻OD值在0.885～1.804范圍內，初始藻液濃度越大，響應時間越短，銅綠微囊藻的葉綠素熒光對Hg2+毒性作用響應越快。

圖3可以看出，銅綠微囊藻OD值為1.804時，加入HgCl2標準溶液后，0～25 min熒光強度隨時間增加，25～35 min熒光強度有下降趨勢，在25 min處熒光強度最大。藻液OD值為1.453時，10 min 以后葉綠素熒光強度急劇增大，20 min后熒光強度趨于穩定。而藻液OD值為0.885時，熒光強度一直隨時間增大，在35 min時還未達到穩定。實驗選用初始藻液濃度OD大于1.400的銅綠微囊藻進行實驗。

2.3 不同濃度Hg2+對銅綠微囊藻葉綠素熒光強度的影響

一定濃度的Hg2+對銅綠微囊藻葉綠素熒光具有明顯的影響。取銅綠微囊藻與HgCl2標準液在50 mL錐形瓶中按體積1∶100比例混合反應，25 min后測定葉綠素熒光強度變化。每一濃度設置3個平行樣，設置一組空白樣(加入100 μL滅菌的蒸餾水)。

結果表明(見圖4)，較低質量濃度Hg2+(0.000 5 mg/L)處理的銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度較對照組熒光強度有所減小，相對熒光強度為負值。0.001～0.400 mg/L Hg2+處理過的銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度有所增加，其相對熒光強度隨Hg2+質量濃度的增大而增大，且在該Hg2+質量濃度范圍內，銅綠微囊藻的相對熒光強度與Hg2+質量濃度呈正相關關系，回歸方程為y=23.699x-0.249，r=0.983 3。而Hg2+質量濃度為0.500 mg/L時，葉綠素熒光強度增大，但相對熒光強度較0.400 mg/L Hg2+處理組的相對熒光強度低很多，與0.300 mg/L Hg2+處理組的相對熒光強度相當，且鏡檢發現藻細胞較正常藻細胞體積增大。

《生活飲用水衛生標準》GB 5749—2006[17]中對金屬汞的限定值為0.001 mg/L，《漁類水質標準》GB 11607—1989[18]中對汞的限定值更嚴，為0.000 5 mg/L。實驗中發現，0.000 5 mg/L的汞濃度脅迫銅綠微囊藻25 min后，銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度減小，相對熒光強度為負值。但田程的研究發現，用該濃度脅迫銅綠微囊藻，在4 h時熒光信號增強，而96 h時藻液熒光信號減弱，對藻的生長和光合作用有不明顯的抑制作用[7]。Hg2+質量濃度為0.050 mg/L時，短時間內使銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度增大，對藻的光合作用有不明顯的抑制作用，在24 h刺激銅綠微囊藻葉綠素a的合成[12]。這說明Hg對銅綠微囊藻的毒性作用不單隨濃度的變化而變化，與響應時間長短也有一定關系。當Hg2+質量濃度為0.500 mg/L時，其相對葉綠素熒光強度小于0.400 mg/L Hg2+處理組，藻細胞體積增大，說明藻的細胞結構發生變化。可能因為隨Hg2+濃度與響應時間的變化，影響銅綠微囊藻生理變化的作用途徑有所不同，這還需要進一步的研究。

圖4也表明在短時間(25 min)內銅綠微囊藻的濃度與Hg2+質量濃度無關。在0.000 5～0.400 mg/L Hg2+的質量濃度范圍內，銅綠微囊藻在680 nm處的光密度不隨Hg2+質量濃度的增大而變化，均為0.400左右。說明短時間內，Hg2+在0.000 5～0.400 mg/L范圍內未對銅綠微囊藻的濃度產生影響。

3 結 論

利用葉綠素熒光技術，通過在銅綠微囊藻中添加HgCl2溶液，測定銅綠微囊藻在435 nm/680 nm處的葉綠素熒光強度的變化來研究銅綠微囊藻葉綠素熒光對Hg2+毒性的最佳響應時間，以及不同濃度的Hg2+在最佳響應時間內對銅綠微囊藻的影響。結果表明，銅綠微囊藻葉綠素熒光對Hg2+毒性的最佳響應時間為25 min，實驗條件為溫度20～30 ℃，銅綠微囊藻的初始藻液濃度OD值大于1.400。當Hg2+質量濃度為0.000 5 mg/L時，銅綠微囊藻的相對熒光強度為負值；當Hg2+質量濃度為0.001～0.500 mg/L時，藻液的相對熒光強度大于零，且在一定質量濃度范圍內(0.001～0.400 mg/L)相對熒光強度與Hg2+質量濃度呈正相關關系，回歸方程為y=23.699x-0.249，r=0.983 3。

參考文獻/References:

[1] GOVINDJEE．Sixty-three years since kautsky：Chlorophyll a fluorescence [J]．Australia Journal of Plant Physiology，1995，22：131-160．

[2] ROHACEK K, BARTAK M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: Basic concepts, useful parameters, and some applications[J]. Photosynthetica, 1999, 37：339-363.

[3] BEUTLER M，WILTSHIRE K H，MEYER B，et al．A fluorometric method for the differentiation of algal populationsinvivoandinsitu[J]．Photosynthesis Research，2002，72：39-53．

[4] LU C M，CHAU C W，ZHANG J H．Acute toxicity of excess mercury on the photosynthetic performance of Cyanobacterium，S．Platensis-assessmentby chlorophyll fluorescence analysis [J]．Chemosphere，2000，41：191-196．

[5] EULLAFFROY P，VERNET G．The F684/F735 chlorophyll fluorescence ratio:A potential tool for rapid detection and determination of herbicide phytotoxicity in algae[J]．Water Research，2003，37(9)：1 983-1 990．

[6] 王 麗，應 波，鄂學禮．水中莠去津的葉綠素熒光定量檢測法[J]．環境與健康雜志，2008，25(7) ：628-630．

WANG Li，YING Bo，E Xueli．Determination of atrazine in water with ToxY-PAM[J]．Journal of Environment and Health，2008，25(7)：628-630．

[7] 田 程．藻類熒光對重金屬毒性響應規律的研究[D]．石家莊：河北科技大學，2010．

TIAN Cheng．Study on the Discipline of Algal Fluorescence Response to Heavy Metal Toxicity[D]．Shijiazhuang：Hebei University of Science and Technology，2010．

[8] 王 帥，梁 英．不同濃度的Cd2+、氮及其交互作用對小球藻的和微綠球藻生長及葉綠素熒光特性的影響[J]．水產科學，2011，30(4)：210-214．

WANG Shuai，LIANG Ying．The interaction of Cd2+and N concentration on chlorophyll fluorescence characteristics in algalChlorellasp．andNannochlorisoculata[J]．Fishery Sciences，2011，30(4)：210-214．

[9] 王曉輝，金 靜，任洪強，等．水質生物毒性檢測方法研究進展[J]．河北工業科技，2007，24(1)：58-62．

WANG Xiaohui，JIN Jing，REN Hongqiang，et al．Development of biotoxicity testing method on detecting water quality[J]．Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2007，24(1)：58-62．

[10] 杜 敏．汞污染對兩種藻類質膜透性的影響[J]．中山大學研究生學刊自然科學版，1996，17(2)：46-49．

DU Min．Effect of mercury pollution on plasma membrane permeability ofSelenastrumcapricornutumandanacystisnidulans[J]．Natural Sciences Journal of the Graduates Sun Yat-sen University，1996，17(2)：46-49．

[11] 殷高方，張玉鈞，王志剛，等．基于熒光傳感方法的藻類在線監測[J]．科技導報，2010，28(23)：40-45．

YIN Gaofang，ZHANG Yujun，WANG Zhigang，et al．Online monitoring technology for algae by fluorescent sensing method[J]．Science & Technology Review，2010，28(23)：40-45．

[12] 田 程，劉 杰，崔建升．HgCl2對銅綠微囊藻的急性毒性效應研究[J]．安全與環境學報，2011，11(4)：5-8．

TIAN Cheng，LIU Jie，CUI Jiansheng．Acute toxicity of HgCl2on the algalMicrocystisaerugmosa[J]．Journal of Safety and Environment，2011，11(4)：5-8．

[13] 劉小靜，吳曉燕，齊彩亞，等．三維熒光光譜分析技術的應用研究進展[J]．河北工業科技，2012，29(6)：422-425．

LIU Xiaojing，WU Xiaoyan，QI Caiya，et al．Applications of three-dimensional fluorescent spectroscopy analysis technology[J]．Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2012，29(6)：422-425．

[14] 王志勤．小球藻內葉綠素a熒光特征的研究[J]．福建分析測試，2012，21(2):31-34．

WANG Zhiqin．Fluorescence characteristics studies of chlorophyll a inChlorellavulgaris[J]．Fujian Analysis & Testing，2012，21(2)：31-34．

[15] SAYED O H，EI-SHAHED A M．Growth, photosynthesis and circadian patterns inChlorellavulgaris(chlorophyta) in response to growth temperature[J]．Cryptogamie Algologie，2000，21(3)：283-290．

[16] 陳蓮花，劉 雷．葉綠素熒光技術在光合作用中的應用[J]．江西科學，2007，25(6)：788-806．

CHEN Lianhua，LIU Lei，Application of the chlorophyll fluorescence in photosynthesis of algae [J]．Jiangxi Science，2007，25(6)：788-806．

[17] GB 5749—2006，生活飲用水衛生標準[S]．

GB 5749—2006，Sanitary Standard for Drinking Water[S]．

[18] GB 11607—89，漁類水質標準[S]．

GB 11607—89，Fishery Water Quality Standard[S]．