正交試驗優選叉枝鴉蔥水溶性多糖的提取工藝

王安銀 孟慶艷 李金鳳 付江花 白紅進

(1 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾843300)(2 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾843300)

叉枝鴉蔥(Scorzonera divaricata Turcz.)系菊科、鴉蔥屬、多年生草本植物，又名拐軸鴉蔥、杈枝鴉蔥、分枝鴉蔥等，是一種耐旱、耐鹽植物，主要分布于草原、半荒漠、荒漠地帶、戈壁和干涸床上，具有固定沙丘、美化環境的作用。鴉蔥始載于《救荒本草》，具有清熱解毒，消腫散結的功能，主治療瘡痛瘟，乳痛，跌打損傷，勞傷，療瘡痛腫和婦女乳房腫脹［1］。目前，國內研究人員對叉枝鴉蔥的化學成分研究主要有鞣質［2］，生物堿［3］，黃酮［4］，尚未見對南疆叉枝鴉蔥水溶性多糖研究報道。本研究采用苯酚－硫酸法［5］測定多糖的含量，以多糖的提取率為考察指標，通過正交試驗優選出叉枝鴉蔥水溶性多糖的最佳提取工藝，為其進一步的研究提供參考依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

紫外－可見分光光度計T6 新世紀(北京普析通用儀器有限責任司);電子天平BS124S(北京賽多利斯儀器系統有限公司);電熱恒溫鼓風干燥箱DHG－9101－2SA 型(揚州鴻都電子有限責任公司);數顯恒溫水浴鍋DK－8D(金壇市醫療儀器廠);旋轉蒸發儀Re－50B(上海申生科技有限公司)。

1.2 試劑

葡萄糖，無水乙醇，石油醚，濃硫酸，苯酚，氫氧化鈉，無水硫酸銅，亞鐵氰化鉀，酒石酸鉀鈉，次甲基藍，硝酸銀，α－萘酚，鐵氰化鉀等均為國產分析純;實驗用水為蒸餾水。

2 材料與方法

2.1 材料

2010年5月于新疆阿拉爾沙漠采集叉枝鴉蔥地上部分，自然陰干，粉碎，過60 目篩，備用。經塔里木大學植物科學學院劉艷萍老師鑒定為菊科叉枝鴉蔥(Scorzonera divaricata Turcz.)植物。

2.2 方法

2.2.1 采用苯酚－硫酸法測定叉枝鴉蔥水溶性多糖的含量。

2.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取經105℃干燥24 h 后的葡萄糖0.01 g，加水溶解并定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 稱取樣品粉末1 g，加30 mL 蒸餾水，80℃水浴回流提取1.5 h，提取1次，抽濾置于100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.3 測定波長的選擇 準確量取對照品溶液和供試品溶液各1 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，依次加入6%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL 搖勻，靜置約5 min 后在沸水浴中水浴15 min，冷卻水冷卻至室溫，然后以蒸餾水做空白，按照紫外－可見分光光度法，在200－800 nm 范圍內進行掃描，確定最大吸收波長為490 nm(結果見圖1)。

圖1 樣品和葡萄糖的紫外－可見吸收光譜

2.2.1.4 葡萄糖標準曲線的制作 準確吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 分別置于10 mL 具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，依次加入6%苯酚1.0mL，濃硫酸5.0 mL 搖勻，靜置約5 min 后在沸水浴中水浴15 min，冷卻水冷卻至室溫，然后以蒸餾水做空白，于490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標制作葡萄糖標準曲線。得回歸方程為:A=10.266C+0.012(r=0.9992)，說明葡萄糖質量濃度在0.01－0.07 mg/mL 范圍內與吸光度呈良好線性關系。

2.2.2 提取工藝研究

2.2.2.1 單因素考察試驗 以固液比、提取時間、提取次數、提取溫度為考察因素，考察其對叉枝鴉蔥水溶性多糖提取率的影響。

2.2.2.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗設計［6］，選固液比、提取時間、提取次數、提取溫度為考察因素，進行4 因素3 水平試驗，研究叉枝鴉蔥水溶性多糖的最佳提取工藝。

3 結果與分析

3.1 單因素考察試驗結果

3.1.1 固液比對多糖提取率的影響 準確稱取干燥至恒重的叉枝鴉蔥樣品5.000 0 g，在提取時間為1 h，提取次數為1 次，提取溫度為80℃的條件下，研究固液比對叉枝鴉蔥多糖提取率的影響，設計固液比為1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，實驗結果如圖2 所示。

圖2 固液比對多糖提取率的影響

圖3 提取時間對多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著固液比的增加，叉枝鴉蔥多糖提取率呈現出先增加后減小的趨勢，當固液比增加到1:40(m/v)時提取率達到最大值;固液比繼續增加時提取率則有所下降。因此叉枝鴉蔥多糖提取的固液比確定為1:40(m/v)。

3.1.2 提取時間對多糖提取率的影響 準確稱取干燥至恒重的叉枝鴉蔥樣品5.000 0 g，在固液比為1:40(m/v)，提取次數為1 次，提取溫度為80℃的條件下，研究提取時間對叉枝鴉蔥多糖提取率的影響，設計提取時間為0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，實驗結果如圖3 所示。

由圖3 可知，隨著提取時間的增加，叉枝鴉蔥多糖提取率呈現出先增加后減小的趨勢，當提取時間增加到1.5 h 時提取率達到最大值;提取時間繼續增加時提取率則有所下降。因此叉枝鴉蔥多糖提取的提取時間確定為1.5 h。

3.1.3 提取次數對多糖提取率的影響 準確稱取干燥至恒重的叉枝鴉蔥樣品5.000 0 g，在固液比為1:40(m/v)，提取時間為1 h，提取溫度為80℃的條件下，研究提取次數對叉枝鴉蔥多糖提取率的影響，設計提取次數為1，2，3，4 次，實驗結果如圖4 所示。

圖5 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖4 可知，隨著提取次數的增加，叉枝鴉蔥多糖提取率呈現出先增加后減小的趨勢，當提取次數增加到3 次時提取率達到較大值;提取次數繼續增加時提取率增加量較小。因此叉枝鴉蔥多糖提取的提取時間確定為3 次。

3.1.4 提取溫度對多糖提取率的影響 準確稱取干燥至恒重的叉枝鴉蔥樣品5.000 0 g，在提取時間為1 h，提取次數為1 次，固液比為1:40(m/v)條件下，研究提取溫度對叉枝鴉蔥多糖提取率的影響，設計提取溫度為50，60，70，80，90，100℃，實驗結果如圖5 所示。

由圖5 可知，隨著提取溫度的增加，叉枝鴉蔥多糖提取率呈現出先增加后減小的趨勢，當提取溫度增加到80℃時提取率達到最大值;提取溫度繼續增加時提取率則有所下降。因此叉枝鴉蔥多糖的提取溫度確定為80℃。

3.2 正交試驗結果 采用L9(34)正交表進行實驗設計，結合單因素試驗結果，進一步考察固液比(A)、提取時間(B)、提取次數(C)、提取溫度(D)對多糖提取率的影響。以多糖的提取率為考察指標，優選多糖提取工藝。用SAS 8.0 對正交結果進行方差分析，實驗安排與結果見表1，表2 和表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果與直觀分析

表3 方差分析表

由表3 可知，在影響叉枝鴉蔥水溶性多糖提取率的因素中，提取時間(B)和提取溫度(D)對提取率有顯著性影響，固液比(A)和提取次數(C)的影響不顯著;由表2 可知，各因素對多糖提取率的影響程度從大到小依次為D ＞B ＞A ＞C，即提取溫度＞提取時間＞固液比＞提取次數。在這4 個因素中，提取溫度和提取時間對提取率的影響最大，固液比影響其次，提取次數影響最小。由此可以得出，水浴法提取叉枝鴉蔥水溶性多糖的最佳工藝條件是:A1B2C2D2，即固液比為1 ﹕35，提取時間為1.5 h，提取次數為3 次，提取溫度為80℃。

3.2.1 最佳提取條件驗證

以正交試驗的最佳提取條件進行驗證試驗，結果如表4。由表4 可知，多糖平均提取率為4.0495%，RSD=1.44%(n=4)，說明應用優化后的試驗條件進行提取，多糖提取率較高，重復性較好。

表4 最佳提取條件驗證(n=4)

4 結論

4.1 本研究采用傳統中藥材提取方法——水浴回流法提取叉枝鴉蔥地上部分水溶性多糖，盡管多糖提取率偏低，但實驗易于操作，成本較低，條件溫和，保證了多糖結構的穩定性。

4.2 根據文獻報道，以及作者對照品溶液和供試樣品溶液的紫外－可見波長掃描結果顯示二者在490 nm 處都有最大吸收峰，故用苯酚－硫酸比色法測定多糖含量，該方法簡單、結果穩定可靠［7－9］。

4.3 采用正交試驗法優化叉枝鴉蔥水溶性多糖的提取工藝。結果表明最佳工藝條件為固液比為1 ﹕35，提取時間為1.5 h，提取次數為3 次，提取溫度為80℃。該優化工藝可為其多糖的進一步分離純化及其生物活性的評價奠定基礎。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1997.13－36.

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［3］陳英，陶大勇，蔣濤，等.四種沙漠植物生物堿的測定［J］.塔里木大學學報，2005，17(1):19－21.

［4］馬國財，陳義磊，王小，強等.叉枝鴉蔥黃酮類化合物提取工藝的研究［J］.光譜實驗室，2011，28(1):286－290.

［5］Michel.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances［J］.Analytic Chemistry，1956，28(3):350－356.

［6］李云雁，胡傳榮.試驗設計與數據處理［M］.北京:化學工業出版社，2005:217.

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［8］符美燕，呂竹芬，陳燕忠.不同化學評價模式在中藥多糖的定量分析中的應用［J］.中國現代藥物應用，2010，4(21):232－234.

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