微生物發酵制備莽草酸的含量測定

沈國鵬 ， 李 莉 ， 班春蘭 ， 吳鳴建 ，2， 黃 強

（1.鄭州大學 化工與能源學院，河南 鄭州 450002；2.河南省化學學會，河南 鄭州 450002）

人禽流行性感冒一直嚴重危害著人類的健康，僅在美國每年因流感住院的患者達15萬人[1]。截止2013年4月21日，中國全國人感染H7N9禽流感確診病例達104例，其中死亡21人[2]。莽草酸（結構見圖1）是化學合成中重要的化工原料，具有抗炎鎮痛和抑制血栓形成的作用，其本身及其衍生物在抗癌和抗病毒方面也有一定的作用[3-4]，可作為一些化學合成制劑和藥物中間體，尤其是抗禽流感疫苗達菲的重要合成原料，在食品和化學工業中有著廣泛的應用[5-8]。莽草酸存在于木蘭科常綠灌木莽草的干燥果實八角中，除此之外，莽草酸還廣泛存在于微生物中。因此可以通過微生物發酵提取莽草酸[9-10]，到目前為止，國外有兩項通過大腸桿菌、枯草桿菌生產莽草酸的專利[11-12]。目前唯一可對流感治療有效的藥物達菲產量受限，全球供應吃緊，其主要原因之一是因為生產達菲的原料莽草酸的短缺。

八角茴香中莽草酸含量的測定通常采用高效液相色譜法[13]，用該法測定八角提取物中莽草酸含量時，需要使用大量的有機試劑，會給環境帶來污染以及對操作人員造成傷害。到目前為止，國際上利用微生物發酵法合成莽草酸的研究尚處于實驗室研究階段，孫曉宇等[14]利用羥基苯甲醛比色法測定了莽草酸的含量。作者利用了紫外-可見分光光度法測定了發酵液中莽草酸的含量，為生物發酵生產莽草酸的研究提供了便捷可靠的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莽草酸標準品；實驗用水為去離子水；莽草酸產生菌菌種 自選；發酵培養基：自制。

TG-16型高速離心機：鞏義市予華儀器有限責任公司產品；WS70-1型紅外快速干燥箱：鞏義市英峪予華儀器廠產品；FA2004型電子分析天平：上海恒平科學儀器有限公司產品；WFZ UV-2102 PC型紫外可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 取50 mL莽草酸產生菌發酵液用離心機以12 000 r/min轉速離心20 min，收集上清液，于245 nm測定吸光度。

1.2.2 對照品與供試品溶液的配制 對照品溶液準確稱取紅外烘干至恒重的莽草酸標準品0.503 8 g，溶于蒸餾水中，然后定容至100 mL，再從中取12 mL定容至50 mL容量瓶中。配制濃度為0.012 1 mg/mL。

供試品溶液 取發酵液，經多次分析其莽草酸含量，取其平均質量濃度為0.097 2 mg/mL。

1.2.3 校準曲線的繪制 準確稱取對照品溶液1、2、4、5、6、7、8、9、10 mL 分別置于 50 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至定容刻度，搖勻。質量濃度為0.024 2、0.048 4、0.096 7、0.120 9、0.145 1、0.169 3、0.193 5、0.241 8 mg/mL。用分光光度計在245 nm測樣品的吸光度，繪制莽草酸標準曲線，列出線性回歸方程。

2 結果與分析

2.1 校準曲線方程

根據測定結果選x軸為莽草酸濃度，y軸為吸光度作圖計算，回歸線性方程為y=3.084 4x-0.004 8。 相關系數：R2=0.999 9（n=8）。 檢出限（按 S/N=3計）為 0.002 5 mg/mL，其線性范圍為 0～0.3 mg/mL。表明在245 nm波長下，吸光度與莽草酸濃度有著顯著的線性關系，可據此方程測定莽草酸（見圖1）。

圖1 莽草酸的線性回歸圖Fig.1 Linear regression graph of shikimic acid

2.2 方法考察

2.2.1 精密度及準確度實驗 準確移取供試品溶液進行精密度測定，測得值為0.097 2、0.097 5、0.097 9、0.097 2、0.097 2、0.096 9、0.097 2 mg/mL。相對標準偏差RSD為 0.32%（n=7），表明具有較高精密度，相對誤差為0.10%，表明具有較高的準確度。

2.2.2 穩定性實驗 取發酵處理液，室溫下放置0、4、8、12、24、48 h 后進行測定， 測得值為 0.104 0、0.103 7、0.103 4、0.102 7、0.102 1、0.101 1 mg/mL。相對標準偏差RSD為1.06%，表明供試溶液室溫放置48 h內穩定。

2.2.3 加標回收率實驗 加標回收率是分析人員在樣品測定時主要的質量控制方法。其大小不僅反映分析人員的操作技術水平，也反映出分析方法是否適用，以便及時的發現分析問題，確保數據的準確性和可靠性[15]。

由此準確稱取對照品 0.055 9、0.054 0、0.056 0、0.051 1、0.052 8、0.051 9、0.056 7 g 于燒杯中，用去離子水溶解并轉入50 mL容量瓶中，分別加入經分析測定質量濃度為0.128 2 mg/mL的樣品，用去離子水定容在245 nm波長處進行分析，測定結果見表1。

表1 加標回收率Table 1 Adding standard recovery

測得回收率在96.7%～103.7%之間，平均回收率為100.04%。說明該方法準確性較好，基本可以保證測量結果的可靠性。

2.3 發酵液中莽草酸的質量濃度的檢測

按照上述檢測方法測定一系列發酵液中莽草酸的質量濃度（4種產生菌發酵液），結果見表2。

紫外-可見分光光度方法的最低檢出限為0.002 5 mg/mL，表2數據與標準樣配置樣分析結果基本一致，表明可以滿足檢測要求。

表2 不同菌體發酵液中莽草酸的質量濃度Table 2 Shikimic acid concent of different bacteria fermented liquid

3 結語

利用紫外-可見分光光度計對微生物發酵生產莽草酸含量的測定，莽草酸的線性方程為A=3.084 4C-0.004 8，相關系數R2=0.999 9。方法的精密度為0.32%，準確度為0.10%，測得加標回收率在96.7%～103.7%之間，平均回收率為100.04%，供試溶液室溫放置48 h內穩定性良好，方法簡便快捷，適于微生物發酵生產莽草酸含量的快速測定。

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