盈江縣耕地土壤高效解磷菌的分離篩選研究

鐘小玉 于波 張晨光

（1河源市清潔生產(chǎn)中心 廣東河源 517000 2青島中一監(jiān)測有限公司 山東青島 266000 3德宏州環(huán)境保護(hù)局 云南德宏 678400）

磷是農(nóng)作物生長所必需的三大元素之一。土壤中全磷的含量是十分豐富的，但是可利用的有效磷含量極低，一般當(dāng)季作物只能吸收5~10%的磷肥，而其中大部分的磷會固定在土壤中，以無效態(tài)磷的形式存在，尤其在暴雨沖刷、下滲、側(cè)滲情況下，磷就會進(jìn)入湖泊、水庫造成水體富營養(yǎng)化。如何利用土壤中無效態(tài)的磷成了國內(nèi)外眾多農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域?qū)W者所研究的熱點(diǎn)課題。

1 材料與方法

一般來說，采樣的最佳時間為晚秋或早春采集土樣，根據(jù)實驗安排采樣時間定為2012年10月23日。

1.1 培養(yǎng)基的制備

根據(jù)余賢美等[1]的研究結(jié)果，以有機(jī)磷液體培養(yǎng)基作為生物富集培養(yǎng)基，然后在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板稀釋法篩選，可以有效的分離篩選土壤中的解磷細(xì)菌。

無機(jī)磷細(xì)菌固體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.5g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Ca3(PO4)210g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，瓊脂粉 18~20g/L，蒸餾水 1L，pH 7.0~7.5。有機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO3 5.0g，（NH4）3PO40.5g，加蛋黃液10mL(蛋黃液為無菌生理鹽水與雞蛋黃1:1配制)，蒸餾水1L，pH7.0~7.5。（生理鹽水：9gNaCl溶于1L水中）。本研究中所用的試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。斜面保存培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：胰化蛋白胨10g，酵母膏 5g，NaCl10g，瓊脂 20g，H2O1L。

1.2 高效解磷菌的分離與篩選

解磷菌的生物富集：稱取處理后的土樣1g加入到100mL有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，于28℃，200～250r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h。

平板稀釋法分離解磷細(xì)菌：按 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的梯度進(jìn)行稀釋，對最后5個稀釋梯度各取0.2mL上清液，每個稀釋度做3次重復(fù)，分別在無機(jī)磷或有機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，觀察平板中菌落生長情況及溶磷圈的產(chǎn)生。將固體培養(yǎng)基上長出的單菌落分別在無機(jī)磷細(xì)菌固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行四分體劃線分離及純化，以獲得純菌株。并根據(jù)溶磷圈直徑與菌落直徑的比值篩選目標(biāo)菌株，并把比值較大的菌株保存在斜面培養(yǎng)基上，放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 水溶性磷測定方法

將純菌株從斜面接種到無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d，再將菌落刮入無菌水中，制成菌體懸浮液，濃度約為108cuf/mL。向250ml三角瓶中加入100ml無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，再接入2ml菌液，同時做空白對照。28℃，轉(zhuǎn)速200~250r/min，連續(xù)培養(yǎng)14d，每隔24h取菌液，3000r/min離心、0.45μm濾膜過濾后，用磷鉬藍(lán)比色法測定濾液中的水溶性磷含量，連續(xù)測定14d。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷圈的測定結(jié)果分析

以有機(jī)磷液體培養(yǎng)基作為富集培養(yǎng)基，以無機(jī)磷固體培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，得到11株具有較大溶磷圈的細(xì)菌。根據(jù)溶磷圈直徑與菌落直徑的比值(HD/CD)大小初步確定11個菌株解磷能力的強(qiáng)弱。其中5株較強(qiáng)的解磷細(xì)菌HD/CD值詳見表1。

由表1可見，PSB23和PSB45這兩株解磷菌的HD/CD值分別為4.31和4.07，是這11株解磷菌中最大的兩株。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)表2、表3的結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第八版[2]，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，PSB23和PSB45菌株初步鑒定為芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。

2.3 解磷菌溶解磷酸三鈣的結(jié)果分析

圖1 PSB23和PSB45的解磷曲線

圖1 可見，隨著時間的推延，兩待測菌株上清液扣除空白后的水溶性磷含量逐漸增加，其中PSB23上清液含磷量第9天出現(xiàn)峰值，水溶性磷含量為174.86mg/L；PSB45號第10天出現(xiàn)峰值，可溶性磷含量為156.32mg/L。出現(xiàn)峰值后，兩待測菌株上清液中水溶性磷含量小幅下降并趨于平衡。

3 結(jié)論

從盈江縣耕地玉米根際土壤中分離出的兩株具有較強(qiáng)解磷功能的菌株P(guān)SB23和PSB45經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定為巨大芽孢桿菌，HD/CD最大值分別為4.31和4.07在以Ca3(PO4)2為唯一磷源的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)14d，最大溶磷量分別為174.86mg/L和156.32mg/L。

[1]余賢美,沈奇賓,李炳龍,等.土壤解磷細(xì)菌分離和篩選方法的建立[J],熱帶作物學(xué)報,2008,29(3):321-325.

[2]R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[M].科學(xué)出版.