光溫條件對三葉青愈傷生長及黃酮積累的影響

錢麗華，毛碧增

(1.浙江大學，浙江 杭州 310058;2.杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024)

三葉青是中國特有珍稀中藥植物，又名三葉崖爬藤、金線吊葫蘆、蛇附子等，含有黃酮、多糖等生物活性成分，對多種癌癥細胞株系具有促進細胞凋亡的作用，且對小兒高熱、支氣管炎、病毒性腦膜炎、血液病、心腦血管疾病、抗艾滋病毒和抗腫瘤治療方面具有療效，被稱為安全無毒的“植物青霉素”。目前因過度采挖其野生資源已瀕臨滅絕。雖三葉青組培快繁和扦插技術均已得到解決，但其塊根形成周期長，產量低，無法滿足市場需求，因此利用組織培養生產次生代謝物是解決供需矛盾的可行途徑之一。

目前對三葉青黃酮的研究集中在藥理作用上，對愈傷組織的研究集中在誘導分化上，對光照和溫度條件的研究還較少［1-5］。本研究旨在探索溫度、光周期等培養條件對三葉青愈傷生長及次生代謝物形成積累的影響，為規模化生產三葉青黃酮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

外植體試驗材料采自建德市，取其葉片為外植體誘導愈傷組織，并以此為試驗材料。

培養基采用MS 基本培養基，蘆丁標準品(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)，微波萃取儀 (美國CEM 公司生產)，UV-2550 紫外分光光度計。無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，亞硝酸鈉(天津博迪化工股份有限公司)，硝酸鋁(上海山浦化工有限公司)，NaOH (杭州化工試劑有限公司)，以上均為分析純。

1.2 處理設計

1.2.1 溫度試驗

將三葉青葉片來源愈傷組織接種在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1中，每處理8 瓶，每瓶接5個。稱取愈傷塊原始質量W0，分別放置在23℃，25℃，28℃，30℃，34℃的光照培養箱中12 h·d-1培養30 d 后，再稱取愈傷塊質量W1，計算30 d 內愈傷鮮重增長率。愈傷鮮重增長率/%=(W1-W0)/W0×100。

1.2.2 光周期試驗

將三葉青葉片來源愈傷組織接種在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1培養基中，每個處理5 瓶，每瓶接種7個愈傷塊，培養溫度為(27 ±1)℃，分別進行24 h·d-1和12 h·d-1光照及暗培養30 d 后，測定各處理愈傷組織中總黃酮的含量。

1.3 總黃酮測定

洗去愈傷組織表面瓊脂，吸干表面水分，置于電熱干燥箱中于105℃下干燥0.5 h，使酶失活;然后60℃干燥后，用研缽磨細，繼續干燥至恒重。測定方法參照文獻［6］(經改良)。

對照品溶液。精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品2.394 5 mg 于25 mL 容量瓶中，加適量50%乙醇超聲溶解，放冷，用50%乙醇定容至25 mL，即為對照品溶液(蘆丁濃度為0.095 78 mg·mL-1)。

供試品60%乙醇溶液。稱取0.3 g 供試品于萃取管中，加入7.5 mL，于微波萃取儀80℃下提取25 min，提取2 次，合并提取液。其他同文獻［6］。

比色測定同文獻［6］方法。

標準曲線。分別移取供試品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，按比色測定步驟執行。

2 結果和分析

2.1 不同培養溫度對葉片愈傷繼代培養的影響

在5個不同溫度處理下，以34℃效果最差，葉片愈傷死亡率高達100%。說明三葉青葉片愈傷對34℃以上高溫較敏感;另外4個溫度處理中，28℃下的葉片愈傷組織鮮重增長率達到394.20%，顯著優于其余各處理;其他3個處理間無顯著差異。故28℃培養溫度最適于三葉青葉片愈傷的生長;超過34℃，則愈傷組織受到高溫傷害后無法修復而逐漸死亡(圖1)。

圖1 不同培養溫度下愈傷鮮重增長變化

2.2 不同光周期對葉片愈傷中總黃酮含量的影響

3種光周期處理后，24 h·d-1光照有利于三葉青葉片來源愈傷組織中次生代謝物黃酮類化合物的積累。該處理下愈傷組織顏色深綠，結構致密，但表層有褐化現象，總黃酮含量達20.23 mg·g-1·DW-1(表1);12 h·d-1光照下愈傷組織淺綠，結構致密;黑暗條件下愈傷顏色為淡黃色，表層組織疏松，總黃酮含量明顯低于24 h·d-1的光照處理。因此，24 h·d-1的光照處理是三葉青愈傷組織中黃酮類化合物積累的適宜培養條件。

表1 光周期對愈傷鮮重增長及總黃酮含量的影響

3 小結與討論

植物組織培養中，光溫條件是影響生長發育的關鍵因子，如何根據植物特性控制培養條件是組培中的重要問題［7］。植物生長發育具有溫度三基點，即最低溫度、最適溫度和最高溫度。在最適溫度下，植物細胞生長、分裂活躍，植物生長最快。本試驗中，28℃是三葉青愈傷生長的最適溫度。

研究表明，光照在誘導分化時可激活某些酶的活性和光誘導的葉綠體代謝產物，從而影響細胞的生長和次生代謝物的積累［8］，但影響的效果因植物種類、試驗材料而異。光照對許多植物中黃酮類化合物的合成有誘導作用［9］，葉綠體分化也與黃酮積累有關［10］，或者光照對苯丙氨酸解氨酶具有激活作用［11］。試驗中，24 h·d-1連續光照有利于三葉青葉片來源愈傷組織中次生代謝物黃酮類物質的積累，而黑暗抑制黃酮化合物的合成。這與彭昕等［2］的研究結果一致。這為今后利用組培技術規模化生產三葉青黃酮提供了技術支撐。

另外，蔗糖、無機鹽、pH、前體物質等對植物組培次生代謝物的形成和積累都存在一定的影響，后期可開展上述因素對三葉青愈傷組織中黃酮積累的影響研究，建立起三葉青愈傷組織生產黃酮的可行技術工藝。

［1］盧愛芳，祁明君，李宗亮，等.三葉青愈傷組織培養及其總黃酮含量的研究［J］.中藥材，2010，33 (7):1042-1045.

［2］彭昕，林言娜，何軍邀，等.培養條件對三葉青愈傷組織生長及總黃酮含量的影響［J］.藥物生物技術，2012，19(2):138-141.

［3］彭昕，張劍，何軍邀，等.三葉青松散型和致密型愈傷組織懸浮培養及黃酮積累的比較研究［J］.中草藥，2012，43 (3):577-580.

［4］彭昕，汪榮斌，何軍邀，等.三葉青顆粒狀愈傷組織懸浮培養系的建立及培養條件的優化［J］.中草藥，2012，34(5):961-965.

［5］吳浩，彭昕，林言娜，等.三葉青愈傷組織誘導及分化培養基篩選［J］.現代農業科技，2011 (21):121-122，125.

［6］樓肖成，郭重.三葉青總黃酮提取工藝研究［J］.海峽藥學，2011，23 (11):9-12.

［7］沈海龍.植物組織培養［D］.北京:中國林業出版社，2005.

［8］盧文蕓，張宇斌，羅迎春，等.不同培養條件對環草石斛愈傷組織中次生代謝產物的影響［J］.安徽農業科學，2009，37 (33):16365.

［9］Fuglevand G，Jackson J.UV-B，UV-A，and blue light signal transduction pathways interact synergistically to regulate chalcone synthase gene expression in Arabidopsis ［J］.Plant Cell，1996，8:2347.

［10］崔剛，唐蕾，王武.培養基和外源激素對銀杏愈傷組織誘導、生長及葉綠素含量的影響［J］.食品與生物技術學報，2008，27 (2):117.

［11］王軍妮，黃艷紅，牟志美，等.植物次生代謝物黃酮類化合物的研究進展［J］.蠶業科學，2007，33 (3):499-505.